HPLC 法测定汉中参叶中人参皂苷Rd 的含量

宋小妹 冯改利 李渊源 葛 莉 王 薇

陕西中医学院，陕西 咸阳 712046

汉中参叶，即珠子参叶。为五加科人参属植物珠子参Panax japonicusC.A.Mey.var.major(Burk.)C.Y.Wu et K.M.Feng的干燥地上茎叶。为陕西秦巴山区民间习用药材，具有清热生津、润喉利咽、安神的功效。主要用于肺热口渴、喉干舌燥、暑热生津、头晕目眩、心焕神散疲等的治疗。民间多以单叶入茶饮用,歌舞艺人常用来保护嗓音,保持体力，解暑。现化学研究表明，汉中参叶富含多种人参皂苷类成分，如人参皂苷Rd、Re、Rg1、Rg2和F2，珠子参苷F1，F2，F3，F4，F5，F6[1-3]，此外，尚含多种氨基酸及微量元素[4]；药理研究表明，汉中参叶总皂苷可对抗二甲苯所致小鼠耳廓肿胀，减少醋酸致小鼠毛细血管通透性增加，抑制肉芽组织增生；对热板引起的疼痛有一定的镇痛效果；能延长缺氧条件下小鼠存活时间[5-6]。为此，本实验采用HPLC 法建立汉中参叶中人参皂苷Rd 的含量，为客观准确评价汉中参叶药材质量，合理开发利用汉中参叶药材资源提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 岛津LC-2010AHT 高效液相色谱仪；Shimadzu LCsolution 工作站；SB-3200D 型超声清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司，180w，40kHz）；BP-121S 电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。

1.2 样品与试剂 汉中参叶采自陕西宁强，经陕西中医学院药学院中药标本馆高级实验师王继涛老师鉴定为珠子参Panax japonicusC.A.Mey.var.major(Burk.)C.Y.Wu et K.M.Feng 的干燥地上茎叶。人参皂苷Rd 对照品（中国固体制剂制造技术国家工程研究中心提供）；乙腈为色谱纯（SK Chemicals 公司），水为娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Iner tsi l ODS-sp（5μm，4.6mm×150mm）；流动相：乙腈：水(32∶64)，检测波长：203nm，流速：1.0ml/min；进样量：10μl；柱温：30℃；理论板数按人参皂苷Rd 峰计算应不低于3000。

人参皂苷Rd 对照品和供试品HPLC 图谱见图1、图2。

图1 人参皂苷Rd 对照品HPLC 色谱图

图2 汉中参叶供试品HPLC 色谱图

2.2 对照品溶液配制 精密称取人参皂苷Rd 对照品4.5mg，置于10ml 量瓶中，加甲醇溶解、定容，摇匀，待用。

2.3 供试品溶液的配制 取参叶粉末2g，精密称定，置锥形瓶中，加甲醇50ml 超声处理30min，过滤，滤液蒸干，加水分散，石油醚反复萃取，每次20ml，弃去石油醚层，再用水饱和正丁醇萃取3次（分别为20、15、15ml），合并正丁醇层，水浴蒸干，残渣用少量甲醇溶解、并转移定容至5ml量瓶中，备用。

2.4 线性关系考察 分别精密吸取人参皂苷Rd 对照品溶液2、5、10、15、20ul 注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，以人参皂苷Rd 进样量（ug）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为Y=126191X-39983，r=0.9998。结果表明，人参皂苷Rd 在9～90ug 范围内线性关系良好。

2.5 精密度考察 取同一供试品溶液，照“2.1”项下色谱条件，重复进样5次，每次10ul，测得人参皂苷Rd 峰面积的RSD 为1.7%，表明本方法精密度良好。

2.6 稳定性考察 取供试品溶液分别于0、2、4、8、12、24h 进样，每次10ul，记录峰面积，计算人参皂苷Rd 的RSD 为1.8%，表明供试品溶液在24h 稳定。

2.7 重复性考察 取同一批样品5份，按2.3项下方法制备供试品溶液，每份进样10ul，测得人参皂苷Rd 含量的RSD 为0.4%，表明本方法重复性良好。

表1 加样回收率试验结果(n=3)

2.8 加样回收率试验 取已知含量的汉中参叶粉末约0.1g，共5份，精密称定，分别准确加入人参皂苷Rd 对照品，按2.3项下方法制备供试品溶液，每份进样10ul 测定人参皂苷Rd 的峰面积，计算平均回收率99.77%，RSD=1.67%（见表1）。

2.9 样品测定 精密称取汉中参叶粉末2.0g，按照供试品溶液制备方法制备样品溶液，进样10ul，测定峰面积，计算含量，结果表明，汉中参叶中人参皂苷Rd 含量为0.51%（n=3）。

3 结果与讨论

3.1 通过实验研究，建立了汉中参叶中人参皂苷Rd 的含量测定方法，实验过程分别对甲醇-水、甲醇-0.4%磷酸水溶液、乙腈-水等的不同配比流动相进行了的考察，结果采用乙腈-水(32∶64)，峰与相邻峰均能达到基线分离，且峰形较好，空白溶剂无干扰。

3.2 实验对提取方法、提取溶媒、提取时间等进行了考察研究，结果表明，用甲醇溶液50ml，超声处理30min，即能提取完全。

3.3 由于样品为地上部分，叶绿素含量很高，因此供试品溶液的纯化制备就成为本项的关键之一。实验过程采用了反复石油醚萃取除去叶绿素，但还不尽理想，时有柱压过高的现象发生，因此，应进一步加强供试品溶液纯化制备方法的研究，以保证测试结果的准确稳定。

[1]杨崇仁，伍明珠，周俊，等．珠子参叶的三萜皂苷成分[J]．云南植物研究，1984，6(1)：118-120.

[2]冯宝树，汪夕彬，王答祺，等．秦岭产珠子参叶的达玛烷型皂甙研究[J]．云南植物研究，1987，9(4)：477-484.

[3]王答祺，冯宝树，汪夕彬，等．秦岭产珠子参叶的达玛烷型皂甙的进一步研究[J]．药学学报，1989，24(8)：633-636.

[4]李映丽，吕居娴，冯变玲，等．参叶-大叶三七叶中氨基酸及微量元素分析[J]．西北药学杂志，1996，4(11)：11.

[5]姜祎，考玉萍，宋小妹．珠子参叶总皂苷抗炎镇痛作用的实验研究[J]．陕西中医，2008，29(6)：732，733．

[6]考玉萍，姜祎，宋小妹．珠子参叶总皂苷抗抗疲劳抗应激作用的实验研究[J]．陕西中医，2008，29(8)：1092，1093.