胃肠舒片对胃肠功能障碍大鼠胃肠道乙酰胆碱及P物质的影响*

李 琼 刘同慎 刘孟安△

1 滨州医学院中西医结合学院（烟台 264003）

2 滨州医学院基础学院（烟台 264003）

胃肠舒片对胃肠功能障碍大鼠胃肠道乙酰胆碱及P物质的影响*

李 琼1刘同慎2刘孟安1△

目的探讨中药胃肠舒片促进胃肠动力作用机理。方法将50只Wistar大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、胃肠舒小剂量组、胃肠舒大剂量组、西沙必利组。除正常对照组外，其余4组均制备胃肠动力障碍动物模型，分别用等容积的受试药液灌胃，连续7d，将各组动物麻醉后选取胃肠标本。免疫组化法观察神经递质Ach及P物质的表达变化，采用图像分析仪测定其肌间神经丛光密度值。结果中药胃肠舒片能明显增加胃肠组织中Ach及P物质分泌，与模型组比较有显著差异。结论中药胃肠舒促进胃肠动力的作用机制，可能是通过增加胃肠道Ach及P物质分泌，Ach及P物质与相应受体结合，增加胞内Ca2+浓度，Ca2+信号系统引发一系列生理功能，从而促进胃肠平滑肌的收缩效应。

中药 胃肠舒片 神经递质 乙酰胆碱 P物质

1 滨州医学院中西医结合学院（烟台 264003）

2 滨州医学院基础学院（烟台 264003）

*国家自然科学基金资助项目（No.30873263）

△通讯作者

中药胃肠舒片是我们研制的促胃肠动力药（批准文号：鲁药制字Z1620030009），对胃肠动力障碍性疾病疗效满意[1～3]。现就其作用机制探讨如下。

1 材料与方法

1.1 材料 Wistar大鼠50只，雌雄各半，体重180～200g，购自烟台绿叶实验动物中心;西沙必利由山东达因海洋生物制药股份有限公司生产;胃肠舒片由滨州医学院附属医院制剂室提供;兔抗大鼠多克隆乙酰胆碱酯酶抗体由武汉博士德生物工程有限公司提供;P物质兔抗大鼠多克隆抗体由北京博奥森生物工程有限公司提供;SP法免疫组化试剂盒由北京中杉金桥生物技术有限公司提供;病理图像分析系统为美国Media Cybernetics产品。

1.2 方法 （1）造模及标本处理：将50只大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、胃肠舒小剂量组、胃肠舒大剂量组、西沙必利组。除正常对照组外，其余4组参考食积动物模型方法[4]制备肠动力障碍实验动物模型。造模成功后各组给予相应药物：正常对照组不给任何药物，模型组给予生理盐水，胃肠舒小剂量组给胃肠舒溶液（含生药75mg/mL），胃肠舒大剂量组给胃肠舒溶液（含生药150mg/mL），西沙必利组给西沙必利混悬液 （含生药0.51mg/mL），均20mL/kg，每日2次灌胃。实验给药第7日各组动物禁食24h（不禁水、药），于次日以1%戊巴比妥钠腹腔麻醉，取胃窦、空肠（十二指肠与空肠交接下0.5cm处）标本，4%冷多聚甲醛固定，常规石蜡包埋切片，厚度5μm。（2）免疫组化法观察神经递质乙酰胆碱及P物质的表达变化：应用免疫组化SP法，取相邻两套切片在60℃温箱烘24h以上，常规脱蜡至水，用0.3%过氧化氢甲醇封闭内源性过氧化物酶30min（室温），微波修复抗原（抗原修复液为pH 6.0柠檬酸缓冲液）10min后室温冷却，经PBS液漂洗后，滴加封闭用正常山羊血清工作液，37℃孵育30min，两套切片分别滴加兔抗大鼠乙酰胆碱酯酶多克隆抗体（效价1∶50）、兔抗大鼠P物质多克隆抗体（效价1∶75），4℃过夜，PBS漂洗5min，共3次，滴加生物素化山羊抗兔二抗工作液，37℃孵育30min，PBS漂洗后，滴加辣根过氧化氢酶标记的链霉卵白素工作液，37℃孵育30min，PBS液漂洗后，DAB显色，将切片置流水中终止呈色反应，苏木素复染，以梯度浓度酒精脱水，二甲苯透明、中性树胶封片待检。（3）图像分析处理：用显微图像分析系统，将待测切片放置在连接计算机的显微镜下，分别对免疫组化染色切片中的阳性表达结果进行定量分析。观察肌间神经丛中阳性神经元的染色及分布情况，每张切片上，每只大鼠胃及小肠组织于40倍物镜下选取5个视野采集图像。将图像扫描至计算机，计算出每个视野阳性染色的光密度（OD）值。

1.3 统计学处理 应用SPSS 13.0统计软件。计量资料以（±s）表示,采用方差分析及组间两两比较。

2 结果

图1 胃肠道乙酰胆碱神经元表达

各组胃肠道乙酰胆碱酯酶与P物质的表达变化、胃窦与小肠肌间神经丛的光密度值结果见表1、图1、图2。从表1可见，模型对照组胃窦与空肠组织中AchE及P物质均低于正常对照组（P＜0.01），说明复制的胃肠动力障碍性动物模型成功，并提示胃肠道兴奋性神经递质Ach及P物质分泌减少是胃肠动力障碍的主要原因。胃肠舒小、大剂量组及西沙必利组用药后，胃窦和空肠组织中AchE及P物质均高于模型对照组 （P＜0.01），胃肠舒大剂量组胃窦组织AchE、胃窦和空肠组织中P物质增加的幅度大于西沙必利组（P＜0.01）。提示中药胃肠舒促进胃肠动力的作用机制与增加胃肠道兴奋性神经递质Ach及P物质分泌有关。

表1 各组胃窦和小肠肠肌间神经丛光密度值比较（±s）

表1 各组胃窦和小肠肠肌间神经丛光密度值比较（±s）

与正常对照组比较，*P＜0.01;与模型对照组比较，△P＜0.01;与西沙比利组比较,▲P＜0.01

正常对照组模型对照组胃肠舒小剂量组胃肠舒大剂量组西沙必利组10 10 10 10 10胃窦0.1611±0.0039 0.1493±0.0076*0.1979±0.0083△0.1981±0.0049△▲0.1750±0.0129△空肠0.1524±0.0089 0.1371±0.0075*0.1899±0.0107△0.1931±0.0135△0.1885±0.0142△胃窦0.1064±0.0057 0.0961±0.0128*0.1099±0.0079△0.1333±0.0056△▲0.1176±0.0072△空肠0.1274±0.0071 0.1117±0.0103*0.1168±0.0077 0.1263±0.0092△▲0.1155±0.0072组 别 n AchE P物质

图2 胃肠道P物质神经元表达

3 讨论

胃肠动力障碍性疾病属于中医学“痞满”范畴，以腹部痞满不舒，或胀痛、纳呆、早饱、食后饱胀、恶心、呕吐、嗳气等为主要临床表现。多由胃肠淤滞，气机不畅，以致脾胃升降失司所致。治疗重在泻胃肠积滞，通胃肠腑气，恢复脾胃升降协调。中药胃肠舒片中大黄泻胃肠积滞,通胃肠腑气为君药;枳实行气消胀，破积除满为臣药;甘草健脾益气，甘缓和中，调和诸药，防大黄攻下伤正之弊为佐使。故诸药相互配伍，以泻胃肠积滞，调畅胃肠气机，恢复脾胃升降协调而达到治疗目的。现代医学认为本病主要病理生理基础为胃排空延迟及小肠传输功能障碍[5，6]。中药胃肠舒能加快胃肠推进运动，其作用机理与其加大胃肠平滑肌自发活动的收缩幅度有关，而对收缩频率无明显影响[7]。故中药胃肠舒片治疗胃肠动力障碍性疾病，其组方既符合中医辨证论治，也符合现代医学观点。

胃肠动力障碍性疾病的发生可能与中枢神经系统、自主神经系统、肠肌间神经丛、胃肠道平滑肌等有关，这些组织结构的功能联系依赖于各种神经递质和体液因子的释放，各种递质与相应的受体结合，执行不同的生理功能，成为胃肠动力药发挥药理作用的生理学基础[8，9]。Ach作为胆碱能神经释放的一种兴奋性神经递质，对胃肠平滑肌的收缩起着重要作用[10]，用于研究生理或病理状态下胃肠运动变化[11，12]。目前公认AchE活性增强则代表Ach释放增加，胆碱能神经兴奋性增高。副交感神经节后纤维释放Ach作用于平滑肌M受体后可开放质膜上L型Ca2+通道，使Ca2+内流使胃肠平滑肌收缩[13～16]。P物质作为一种重要的胃肠肽，对胃肠道的兴奋作用表现为对胃肠纵行肌和环行肌的双重收缩效应，包括直接的短时作用和紧随的由胆碱能神经释放Ach引起的长时作用[17]。P物质与其相应受体结合,激活磷酸脂酶C,使磷脂酰肌醇二磷酸水解,产生肌醇三磷酸而使胞内钙浓度升高，Ca2+信号系统引发一系列生理功能，包括胃肠平滑肌的收缩效应[18]。实验显示SP可激活两种不同的钙内流通道[19]。本研究表明，模型对照组胃窦及空肠AchE及P物质较正常对照组显著减少，提示复制胃肠动力障碍的动物模型成功。经用中药胃肠舒片后，胃窦和空肠部AchE及P物质的分泌均较模型对照组显著增加。结合既往研究证实中药胃肠舒片能显著增加胃肠平滑肌细胞游离Ca2+浓度[20]，笔者认为中药胃肠舒片促胃肠动力的作用机制，可能是通过增加胃肠道Ach及P物质的分泌，Ach及P物质与相应受体结合，增加胞内Ca2+浓度，Ca2+信号系统引发一系列生理功能，而促进胃肠平滑肌收缩效应。

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Influence of Weichangshu Tablet on Ach and Substance P in Gastrointestinal Tract of Rats with Gastrointestinal Dysfunction

LI Qiong1,LIU Tong-shen2,LIU Meng-an1△
1 Integrated Traditional and Western Medicine College of Binzhou Medical University（Yantai 264003）
2 Basic College of Binzhou Medical University（Yantai 264003）

Objective:To investigate the effect of Weichangshu Tablet on gastrointestinal motility.Methods:50 Wistar rats were divided into 5 groups randomly:normal group,model group,low dosage Weichangshu Tablet group,high dosage Weichangshu Tablet group and cisapride group.In addition to the normal group,the other 4 groups were prepared animal models of gastrointestinal motility disorder.The groups were given the same volume solution of corresponding medicine by gastric perfusion for 7d.The gastrointestinal samples were taken after rats were anesthetized.The expression change of Ach and substance P were determined by immunohistochemical method.The optical density of myenteric plexus were measured with mitrosperegraph.Results:Weichangshu Tablet could effectively increase Ach and substance P in gastrointestinal tract.Compared with model group,there was significant difference.Conclusion:The mechanism of Weichangshu Tablet promoting gastrointestinal motility may be that can increase Ach and substance P,which act on corresponding receptors and enhance the Ca2+concentration then the Ca2+signal system cause gastrointestinal smooth muscle contraction.

Traditional Chinese medicine;Weichangshu Tablet;Neurotransmitter;Acetylcholine;Substance P

R285.5

A

1004-745X（2010）01-0096-03

2009-07-28）