侧脑室注射 Noggin对 AD小鼠海马神经发生和学习记忆功能的影响

高长越, 范晓棠, 方传勤, 王延江, 张莉莉, 李敬诚, 周华东

随着人口老龄化,老年期痴呆越来越引起人们的关注。阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是老年期痴呆中最常见的一种类型,临床表现为不可逆进行性发展的记忆减退、认知下降、语言与人格障碍等。其特征性病理学改变为大脑皮层和海马细胞内神经元纤维缠结(neuofibrillary tangle,NFT)、细胞外大量老年斑(senile plaque,SP)形成及神经元缺失[1]。目前在世界范围内已成为引起老年人死亡的主要原因,全世界现有患病人数在 2千万以上[2]。随着我国人口老龄化问题的日益突出,对 AD的防治显得非常迫切。到目前为止,AD在临床上还缺乏有效的治疗措施。

神经干细胞(Neural stem cell,NSCs)增殖、存活和分化的过程称为神经发生(neurogenesis)。研究证明神经发生主要在哺乳动物脑内两个区域——海马齿状回(subergranular zone,SGZ)、室管膜下区(suberventricular zone,SVZ)终生存在[3,4]。海马齿状回颗粒细胞更是在学习记忆机制中发挥重要作用。多项研究已表明 AD海马神经发生减低与记忆功能减退有关[5]。AD重要的病理特征之一是神经元的丢失,因此促进内源性神经发生来替代治疗AD是重要的临床策略之一。既往的研究发现,Noggin在海马锥体细胞及齿状回颗粒细胞有高丰度表达,反义核酸抑制海马内 Noggin表达后,可损害大鼠学习记忆能力,并降低海马齿状回神经增殖,提示Noggin对海马神经元的存活和损伤修复可能具有重要意义[6]。为此我们以 12月龄 APP/PS1双转基因AD小鼠模型为基础,观察了在侧脑室注射 Noggin后海马神经发生的变化和学习记忆功能的改变,探讨了 Noggin在 AD中的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 12月龄健康雄性 APPswe/PS1dE9转基因 AD小鼠 20只,质量 32.2～43.1g,均源于美国 Jackson实验室。BrdU、Noggin及抗鼠BrdU单克隆抗体购自 Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组 小鼠按抛硬币法随机分为生理盐水对照组、Noggin注射组各 10只。注射组小鼠均经 3%戊巴比妥钠腹腔麻醉后固定于江湾Ⅰ型立体定向仪上。按 Paxinos和 Watson立体定位图谱,以前囱为零点,在前囱后 1.0mm、右侧 1.5mm和 4.0mm深度置入不诱钢管,导管外径 0.5mm,内径 0.3mm,用 502胶和牙托粉泥固定于颅骨表面,便于多次侧脑室注射。

1.2.2 Noggin侧脑室注射 Noggin注射组给予侧脑室注射,微量注射的方法:右侧脑室内导管插入术后,将外径为 0.3mm的内套管插入该导管内,其末端比导管末端长 1mm,外端经一细塑料管 2μl微量注射器相连接,Noggin共 3μl(1μg/μl),以 0.5μl/min速度注入侧脑室内,注射完毕停留 2min拨出内套管,每天注射 1次,共 7d。生理盐水对照组仅给予 3μl生理盐水注射。

1.2.3 Brd U腹腔注射及免疫荧光检测 7d注射完毕后每组各取 4只小鼠给予BrdU腹腔注射,剂量 100mg/kg,注射时在动物房通风厨内进行,抓取小鼠时尽量轻柔,避免惊吓等刺激,每天 2次,间隔 12h,连续 4d。均于最后 1次 BrdU注射后 5d杀死动物并灌注、取材,行冠状冰冻切片,片厚 35μm,每隔 6张取 1张切片,取其中 1套(约 10张含海马结构)进行免疫荧光染色并计数,累加后乘 6即为一侧海马齿回总的阳性细胞数。

新鲜配置 3%H2O2,室温浸泡 5～10min以灭活内源性酶;4%布安液(4%甲醛/1%苦味酸/5%醋酸)固定 15min;2mol/L HCl浸泡 1h;0.1mol/L硼酸缓冲液中和 2min×3次,PBS洗涤 10min×3次,加封闭用血清,室温 30min。滴加兔抗 Brdu一抗(1∶5000),恒温下(4℃)孵育 24h;PBS冲洗 10min×3次,加入封闭缓冲液配制的二抗为[羊抗鼠 IgG1 Cy3(1∶500)],避光室温 2h,避光条件下,0.01mol/L PBST洗涤 10min×3。避光条件下,贴片、避光、阴干、稀释的甘油封片、4℃避光保存,1min内进行荧光显微镜观察。

1.2.4 AD小鼠的行为学检测 7d注射完毕后注射组小鼠取出套管,局部碘伏消毒并缝合皮肤,各组余下 6只 Morris水迷宫进行行为学检测。水池分为 4个象限,分别称 SW、NW、SE、NE象限,在 NE象限正中放置一直径 6cm的平台,平台顶低于水面0.5cm。实验室内光线良好,水温维持在(25℃ ±0.5℃),摄像机安置于水池上方 2.5m处,并与安装有示踪软件的计算机相连。(1)定位航行实验(place navigation test):实验前 1d下午将小鼠放入水中自由游泳 2min,使其熟悉实验环境。实验历时4d,每天上、下午两个时间段,每个时间段训练 4次。每次训练随机选择一个入水点将小鼠面向池壁放入水池,记录小鼠找到平台的时间,即逃逸潜伏期(escape latency)。至 90s找不到平台,即将其引上平台,潜伏期记为 90s。每一时间段内 4次潜伏期的算术平均值作为这一时间段的学习成绩。(2)空间探索实验(spatial probe test):训练 4d平台实验结束后,小鼠在笼中停留 2h。然后撤除平台,进行空间探索实验。将小鼠放至池中,记录实验小鼠在 60s内穿越平台所在象限的次数,计算小鼠在平台所在象限的游泳时间占总时间的百分比。

2 结 果

2.1 Noggin侧脑室注射对 AD小鼠学习记忆的影响 将小鼠从 1d到 4d的训练结果记录下来,发现随着训练时间的延长,各组小鼠找到平台的时间随着训练天数增加均有缩短,但下降的速率不一致,Noggin侧脑室注射组小鼠平均逃逸潜伏期在每个时间段短于生理盐水对照组(P＜0.05),我们观察到各组小鼠中,随着训练时间延长,游泳速度有减慢的倾向,但同组每天以及组间彼此之间游泳速度相差均不明显(P＞0.05),(见图1)。空间探索实验中,Noggin侧脑室注射组在原平台象限探索时间百分率明显大于对照组小鼠(P＜0.05);对照组大鼠穿过原平台位置次数也明显少于 Noggin侧脑室注射组(P＜0.05)(见表1)。

2.2 各组 AD小鼠海马齿回 BrdU的检测BrdU作为 DNA前体类似物替代掺入 S期细胞,活体注射而后利用抗 BrdU单克隆抗体,结合荧光标记显示增殖细胞。本实验可见 BrdU阳性细胞大都位于颗粒细胞层与门区之间,即所谓的颗粒细胞下层,往往紧密排列、成簇出现,细胞形状不规则,多呈椭圆型或圆形。Noggin侧脑室注射组小鼠 BrdU阳性细胞数(232.24±16.38)与对照组(125.21±16.32)比较明显增加,差异非常显著(P＜0.01)(见图2)。

表1 撤除平台后 60s内穿过原平台位置次数及在原平台象限探索时间百分比±s)

表1 撤除平台后 60s内穿过原平台位置次数及在原平台象限探索时间百分比±s)

*P＜0.05

Noggin注射组对照组41.52±6.29%*32.32±4.80%4.02±0.65*3.51±0.31

图1 Morris水迷宫检测 Noggin侧脑室注射及对照组 AD小鼠逃逸潜伏期、游泳速度

图2 免疫荧光检测两组 AD小鼠海马 BrdU阳性细胞数(箭头所示,200×)

3 讨 论

近年来神经干细胞(neural stem cells,NSCs)领域的迅速发展为包括 AD在内的神经系统变性疾病的替代治疗打开了一个全新的研究方向。研究证明在哺乳动物脑内海马齿状回颗粒细胞下层(SGZ)神经干细胞能够增生分化成为神经元并整合到复杂的神经环路中。在成年哺乳动物及人类的海马齿回的NSCs的增殖、分化、迁移和整合因与记忆形成密切相关[5]。通过有效干预 AD脑内内源性的神经发生,从而达到对 AD相关的选择性神经元丢失的治疗有较好前景。有关 AD脑内神经发生的变化,多数体内和体外研究显示 AD脑内神经发生下降[7～9]。其中 AD脑内神经发生下降构成了 AD病理生理机制的重要环节。因而如何促进 AD脑内海马的神经发生在 AD防治领域具有重要意义。

Noggin与骨形成蛋白 4(bone morphogenetic protein 4,BMP4)是胚胎期神经发生的重要调控分子,在原肠胚期共同参与神经板和神经管的发生过程,其中 BMP4抑制分离的外胚层细胞向神经元分化,促进这些细胞向上皮细胞分化;而 Noggin作为BMP4的拮抗结合蛋白,与 BMP4的亲和性较高,可阻滞 BMP4与其相应的受体结合,从而抑制 BMP受体信号通路,促进这些细胞向神经元分化[10]。目前已证明,Noggin不仅在胚胎期,在成年哺乳动物 CNS与外周神经系统的发育及神经发生起重要作用[11]。Noggin在成年大鼠 CNS内皮质、海马、嗅皮质、小脑的蒲肯野细胞等部位的神经元均有一定水平的表达,但以前皮质与海马表达水平最高,前皮质和海马与学习记忆等脑的高级认知功能密切相关。以前研究发现,侧脑室注射 Noggin反义寡核苷酸能抑制大鼠海马齿状回神经增殖,并且明显抑制学习记忆能力[6],表明 Noggin的确与成年大鼠学习记忆相关。本实验所选择的 12月龄 AD小鼠相当于疾病的进展阶段,我们通过向 AD小鼠侧脑室注射 Noggin来观察其对海马神经发生和学习记忆的影响。本实验中的Morris水迷宫是目前检测实验动物学习记忆水平最常用和重要的工具,是英国心理学家 Morris于20世纪 80年代初设计,并成为研究与海马功能直接相关的空间学习记忆模型,是目前普遍使用检测实验动物学习记忆水平的重要工具。本实验参照Yau、McNair等[12]的方法进行了改进,将测试次数、潜伏期作相应修改,来对小鼠进行行为学检测。BrdU标记技术是目前研究神经发生应用最为广泛的一项技术。非放射性标记物 5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU)为胸腺嘧啶的衍生物,掺入 S期细胞,能与内源性胸腺嘧啶竞争掺入新合成的 DNA。活体注射或细胞培养加入,而后利用抗 BrdU单克隆抗体,ICC染色,显示增殖细胞。本研究发现 AD小鼠在侧脑室注射 Noggin较生理盐水注射组学习记忆能力明显改善。同时,用 BrdU标记海马神经干细胞增殖中发现,AD小鼠在侧脑室注射 Noggin较生理盐水注射海马神经干细胞增殖增加。本研究结果表明 Noggin可促进 AD小鼠海马神经发生,并改善 AD小鼠的学习与记忆功能。Noggin对于 AD小鼠学习记忆能力的改善可能是与Noggin能促进海马神经发生有关。我们既往研究证实[13],BMP4与 Noggin调控不同年龄段大鼠海马的神经发生。Noggin基因亦是目前在体内与体外均被证实有神经诱导作用的神经诱导剂,并且分泌性Noggin蛋白与 BMPs有较高的亲和力,因而干扰BMPs与相关受体的结合,因此其神经诱导作用也可能主要与拮抗 BMP2/BMP4的作用有关。

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