3-硝基丙酸预处理对大鼠脑组织缺血-再灌注损伤的保护作用与神经细胞骨架蛋白的相关性研究

周春奎, 胡雪峰, 赵 腾, 常 明, 张海宁

有报道称[1],对大鼠进行小剂量 3-硝基丙酸(3-nitropropionic acid,3-NPA)预处理不但不会产生神经组织学损伤,反而对再次发生的局灶性脑缺血产生耐受性,此现象的机制已成为研究热点。目前,在蛋白质组学水平研究 3-NPA对脑缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,IRI)的保护机制尚未见报道。本实验采用 Zea Longa的大脑中动脉线栓法并加以改进,建立局灶性脑缺血-再灌注模型,以小剂量 3-NPA对预处理组大鼠进行干预,应用差异蛋白质组学结合质谱鉴定找出预处理组与对照组差异表达的神经细胞骨架相关蛋白,通过对存在差异的神经细胞骨架蛋白进行功能分析,为进一步探讨 3-NPA预处理在 IRI后产生的脑保护作用提供线索。

1 材料与方法

1.1 材料 CyDye花青素荧光染料(Cy2,Cy3,Cy5)、24cm固相 pH梯度干胶条(Immobilized pH gradient,IPG,pH 4～ 7)、CHAPS、两性电解质 (pharmalyte,p H 3～10)、二硫苏糖醇 (DTT)、碘乙酰胺(IAA)、尿素、丙烯酰胺、甘氨酸、Tris、SDS、Clean-up试剂盒购自 GE Healthcare-Amersham Biosciences(Uppsala,Sweden);L-谷氨酰胺和 3-NPA购自 Sigma Aldrich(Saint Louis,USA)。

1.2 仪器 IPGphor II等电聚焦仪、DALTSix电泳系统、Typhoo9400系列多功能激光扫描成像系统、DeCyder差异分析软件和 MALDI-TOF质谱均为GE Healthcare-Amersham Biosciences公司产品。

1.3 动物及分组 雄性 Wistar大鼠 20只,体重 250～300g,由吉林大学基础医学院实验动物中心提供及饲养。随机分组:(1)生理盐水 +缺血再灌注组(对照组);(2)3-NPA预处理 +缺血再灌注组(预处理组)。3-NPA浓度为 4mg/ml,实验前用双蒸水新鲜配制,用 NaOH调节 pH至 7.4。预处理组大鼠腹腔注射 3-NPA(20mg/kg),对照组腹腔注射等体积生理盐水,于 72h后分别制作脑缺血-再灌注模型。

1.4 大脑中动脉缺血-再灌注模型制备 采用Zea Longa的大脑中动脉线栓法(MCAO)并加以改进,建立局灶性脑缺血-再灌注模型,大鼠术后 2h完全清醒、神经功能障碍评分达 3分、且再灌注 72h后未死亡的动物纳入实验。

1.5 蛋白质样品的制备 大鼠术后分别于72h腹腔内注射 10%水合氯醛麻醉,快速断头处死,冰上剥离左侧大脑,用预冷超纯水冲洗脑组织中残留血液,取梗死病灶侧大脑皮层约 100mg(湿重),放入研钵内,加入提取裂解液 500μl,同时加入 1%核酸酶和 1%蛋白酶抑制剂,混匀,冰浴研磨匀浆,研磨时避免产生气泡。室温变性作用 60min,然后15℃,25000r/min离心 30min,收集上清液。蛋白样品参照 2D Clean-up试剂盒说明书去除杂质。用Bradford法测定蛋白质样品浓度。

1.6 CyDye荧光染料标记蛋白质样品 将各样品 pH值调至 8.5,每份样本 50μg避光条件下加入 1μl(400pmol/L)的 CyDye(Cy3、Cy5、Cy2)荧光工作液,其中 Cy2标记 20个样本各 25μg组成的混合物作为内标,具体标记情况如表1所示。参照 Skynner法避光冰浴 30min后,加入 1μl 10mmol/L赖氨酸终止反应。

表1 DIGE胶内样品分组及组成

1.7 荧光差异双向凝胶(DIGE)电泳制备 分别混合标记后的 3块胶样品及内标,用重泡涨液(7mmol/L尿素,2mmol/L硫脲,4%CHAPS,1%IPG buffer,40mmol/LDTT,痕量溴酚蓝)定容至 450μl。在 20℃,用 IPGphorⅡ等电聚集仪,将 24cm IPG胶条水化重泡涨 6h,按表2所示参数进行等电聚集电泳。等电聚焦(参数见表2)后,将胶条分别放置在含 2%DTT和 4%IAA的平衡液中各振荡平衡 15min,再移至 12.5%的 SDS-PAGE胶(24cm×20cm×1.0mm)上端,酸性端旁置蛋白分子量标志,20℃在 DALTSix电泳仪中 40mA恒电流电泳,直至溴酚蓝到达胶的底端。用 Typhoon 9400成像系统扫描双向电泳凝胶,各荧光染料的激发光和发射光波分别为:Cy2,480nm和 530nm;Cy3,540nm和 590nm;Cy5,620nm和 680nm。扫描后的图像文件用 DeCyder5.0版本软件分析,应用 BVA模式进行胶与胶之间匹配,不同组间选择 Student检验和单因素方差分析(One-Way ANOVA)。挑选出两组间具有统计学意义(P＜0.05)的显著增加或者显著减少的感兴趣差异蛋白点。

表2 等电聚焦电泳参数

1.8 质谱分析及蛋白质鉴定 取对照组及预处理组蛋白样品各 800μg,按常规方法进行制备胶双向电泳后,经考马斯亮蓝染色,用 Ettan Spot Picker(Amersham Biosciences)机器人挖取与感兴趣差异蛋白相匹配的蛋白点。参照 Wilm方法,对所挖取的蛋白点用 50%乙腈冲洗,胰蛋白酶消化,以 Ettan Spotter(Amersham Biosciences)在靶条上进行样品点样后,应用基质辅助激光解析/电离-飞行时间(MALDI-TOF)质谱分析蛋白质肽质量指纹谱,并将结果输入 NCBI和 Swiss-Prot蛋白质数据库进行检索。

2 结 果

2.1 DIGE比较各组大鼠脑组织蛋白质差异分析 经 DeCyder-DIAV5.0软件分析 Cy2、Cy3、Cy5染色的内标和对照组及预处理组的 3块胶,结果可见两组间胶上的蛋白点分布模式基本一致,每块胶上平均含有 2668个蛋白点,其中可匹配的蛋白点 2080个。应用 DeCyder-BVA软件分析蛋白质表达量差异,发现 72h预处理组与对照组相比有 52个蛋白点表达量显著改变(见图1)。

2.2 差异蛋白质点的质谱鉴定和数据库检索通过质谱分析及数据库检索鉴定出3-NPA预处理组与对照组之间存在明显差异的蛋白质有 15种,其中神经细胞骨架相关蛋白 7种,具体如下:ERM家族蛋白(ezrin蛋白、radixin蛋白和 moesin蛋白)、神经细丝蛋白轻链多肽(neurofilament light polypeptide,NF-L)、神经细丝蛋白中链多肽(neurofilament medium polypeptide,NF-M)、二氢嘧啶酶相关蛋白 2(dihydropyrimidinase-related protein 2,DRP-2)、巢蛋白(nestin),以上 7种蛋白预处理组较对照组表达均显著增高(见表3)。

表3 神经细胞骨架相关蛋白鉴定结果

图1 制备胶图像显示差异表达的蛋白,绿圈内为 3-NPA预处理组与 IRI组的差异表达点

3 讨 论

缺血-再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,IRI)是指各种原因造成局部组织器官缺血,使组织细胞发生缺血性损伤,当在一定条件下恢复血液再灌注后,组织细胞的代谢功能障碍及结构破坏未减轻反而进一步加重。IRI往往引起较缺血本身更为严重的损害,导致各种神经功能缺损的症状,其机制较多,目前公认的有氧自由基、钙超载、炎症反应等[2]。细胞骨架蛋白主要功能是维持真核细胞的空间结构,包括微管、微丝或肌动蛋白丝以及中间丝 3种类型。越来越多的事实证明,对细胞骨架的保护在脑损伤恢复中具有重要的意义。细胞骨架的研究将成为缺氧缺血性脑损伤研究的热点。

预适应(preconditioning)是指一次或多次短暂、非致命性刺激后,机体、组织或细胞能对其后一段时间内严重、甚至致命性损伤产生一定程度耐受的现象,其机制包括低氧诱导因子生成、基因表达的上调等[3]。近年来研究发现,一些药物或化学预处理可以诱导脑组织产生保护作用,称为药理性预适应。3-NPA是琥珀酸脱氢酶抑制剂,其进入机体后与琥珀酸脱氢酶共价结合,抑制线粒体电子传递和氧化磷酸化过程,阻断呼吸链,引起组织缺氧。Wiegand等[1]报道,小剂量 3-NPA(20mg/kg)预处理不足以产生神经组织学损伤,反而对再次发生的严重局灶性脑缺血缺氧产生耐受性。3-NPA预处理具有时间依赖性,预处理后 3～24h即产生效应,持续 1～4d,以预处理后 3d效应最佳。Riepe等[4]发现在大鼠腹腔注射 3-NPA 20mg/kg预处理后 1d,脑海马切片耐受缺血能力明显提高,神经元密度增加约 50%。此外有研究将体外培养的皮层神经元用 3-NPA预处理,发现预处理后数小时至 2d这些神经元抗缺氧能力明显增强。目前认为,3-NPA预处理后可以激活机体自身内源性保护机制,提高神经元对缺血缺氧的耐受性,提高脑组织的抗损伤能力。本实验应用差异蛋白质组学技术,鉴定了 3-NPA预处理组大鼠与IRI组大鼠之间存在差异的蛋白质 15种,其中神经细胞骨架相关蛋白 7种。

3.1 REM蛋白家族 ERM蛋白家族(ezrin/radixin/moesin)是连接皮层细胞骨架与质膜上整合膜蛋白的桥梁分子,其通过介导细胞质膜与肌动蛋白等细胞骨架的连接,在细胞的生长、运动、迁移、有丝分裂以及信号转导等方面发挥重要作用[5]。在神经系统中,ERMs蛋白主要表达于新皮层的中间带,这个区域密集了迁移的神经元和生长的轴突。在皮层形成过程中,ERMs是主要的细胞骨架连接器,在神经元迁移和轴突延伸过程中发挥重要的功能[6]。有实验表明,在培养的原代神经元细胞中抑制 ERMs的表达,可抑制生长锥和神经元轴突的形成[7]。由此可知 ERMs在维持神经细胞结构及促进轴突生长方面具有重要的生物学作用。

3.2 神经细丝蛋白轻链多肽(NF-L)及中链多肽(NF-M) 神经细丝蛋白(neurofilament protein,NFP)是神经细胞特异蛋白,属于中间丝。NFP广泛的分布在神经细胞的细胞质、神经突起内。脊椎动物的 NFP是由分子量 70kD(L)、145kD(M)、200kD(H)三种不同的蛋白亚基组成的,神经细丝蛋白轻链多肽(neurofilament light polypeptide,NF-L)亚基出现最早并构成 NF的核心,神经细丝蛋白中链多肽(neurofilament medium polypeptide,NF-M)及神经细丝蛋白重链多肽(neurofilament heavy polypeptide,NF-H)亚基通过 NF-L亚基构成螺旋状三联体,维持神经细胞骨架的维持。另外,NFP多肽由细胞质产生、通过顺行性慢速轴索流向终末,参与物质运输[8]。由此可知,NF-L和 NF-M表达增高可通过维持神经元细胞功能及加速轴浆运输,起到神经保护的功能。

3.3 二氢嘧啶酶相关蛋白 2(DRP-2) DRP-2参与脑组织的细胞骨架组成[9],是一种参与神经分化与轴突形成的蛋白,与轴突的生长和可塑性密切相关。另有研究显示[10],在卒中后的皮层和纹状体的缺血半暗带区的肥大细胞中 DRP-2 mRNA表达明显上调,参与缺血时神经元的细胞防御机制。目前认为,缺血可激活中枢神经系统的潜在的破坏性和保护性蛋白质的合成,而 DRP-2即是一种神经系统缺血时的保护性蛋白。

3.4 巢蛋白 巢蛋白(nestin)是一种新近发现的中间丝蛋白,属于细胞骨架蛋白,是神经干细胞特异性标志物[11]。这种蛋白在哺乳动物胚胎期 CNS的神经前体细胞内大量表达,动物出生后其表达很快降低并消失。但在少数仍保持神经发生功能的部位(如大脑室管膜下区、嗅球、海马齿状回)仍有表达。有研究证明,成熟的神经元是巢蛋白阳性细胞的基础,在损伤后被诱导表达,其中在迷走、喉返神经损伤后,疑核中的神经元可能有更新的潜力[12]。脑缺血性损伤时,脑室下区和海马齿状回巢蛋白细胞表达增加,在缺血中心区和周边区如纹状体、皮质、海马也出现表达增高。目前巢蛋白已经广泛用于神经干细胞的鉴定,巢蛋白的高表达预示着神经干细胞的激活。脑缺血时,缺血区神经元坏死或凋亡,激发非供血区已成熟神经元重返胚胎神经上皮细胞特征并分泌巢蛋白,作为适应缺血性脑损伤的一种代偿性反应,或者缺血激活非缺血区脑实质内处于静息状态的神经干细胞,向神经元方向分化,迁徙到缺血区以补充神经元的不足。

综上所述,通过差异蛋白质组学研究,根据各种蛋白的特性,考虑 3-NPA预处理的神经保护机制可能涉及 ERMs蛋白家族、神经细丝蛋白、二氢嘧啶酶相关蛋白 2等细胞骨架相关蛋白的调节表达,通过维持神经细胞结构及促进轴突生长,加速轴浆运输,促进神经干细胞激活并定向分化成神经元,最终增加脑组织对缺血-再灌注的耐受性,起到脑保护作用。

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