肾透明细胞癌组织中miRNA-185水平的变化及其意义

杨 宇,徐仁芳,何小舟,徐海燕

(苏州大学a.研究生院2008级;b.第三附属医院泌尿外科,江苏常州213003)

微小RNA(miRNA)是一类分布广泛的、大约22个核苷酸的内源性非编码 RNA,通过控制靶miRNAs,达到调控靶基因的表达或翻译。miRNAs在生物的生长发育过程中发挥着非常重要的调节作用,目前的研究证实肿瘤的发生、发展与miRNAs之间存在着错综复杂的关系,大约有一半的 miRNAs其上游基因位于染色体中及肿瘤相关的区域内,而且多种肿瘤中均存在微小RNA(miRNA)异常表达[1]。提示miRNAs可以起到肿瘤抑制基因或者癌基因的功能,并且miRNAs与肿瘤的发生、发展、诊断及预后判断等方面均存在密切的联系[2]。另外,在肾脏方面,敲除了肾小球足突细胞特异性的微小RNA(microRNA)合成关键酶的小鼠迅速出现大量蛋白尿,从而导致肾小球和肾小管严重的急性损伤,并很快因急性肾功能衰竭死亡[3],提示microRNA对于维持肾小球滤过屏障至关重要。本研究通过观察miRNA-185在肾透明细胞癌组织中的表达,旨在为探讨miRNA-185及其他miRNA在肾癌中的生物学功能以及与肿瘤的关系提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选择2008年11月至2010年5月在苏州大学第三附属医院泌尿外科进行手术切除并保存于液氮中的肾癌组织标本(肾癌组)22例,男13例,女9例,年龄35～78岁。术后病理诊断均为肾透明细胞癌。病理学分期:G1(高分化癌)4例,G2(中分化癌)12例,G3(低分化癌)6例。选择同期肉眼观癌旁正常组织(癌旁正常组织距离肿瘤边缘＞5 cm)标本(癌旁组)22例。

1.2 主要试剂与仪器

microRNA快速提取试剂盒(百泰克公司),miScript Reverse Transcription Kit、miScript SYBR?Green PCR Kit(德国QIAGEN公司),miS-cript Primer Assays(德国QIAGEN公司),常规试剂由常州市第一人民医院泌尿外科实验室提供。DU800紫外分光光度计(美国BECKMAN COULTER公司),ChemiDocTM XRS+电泳照胶仪(美国BIORAD公司),ABI 7500 Real-time PCR仪(美国ABI公司),EPPENDORF 5332型普通PCR仪(德国EPPENDORF公司),Himac CT15E低温超速离心机(日本Hitachi公司)。

1.3 方法

1.3.1 2组组织标本中miRNA的提取

使用microRNA快速提取试剂盒提取、纯化2组组织标本中的miRNA,后溶于无RNAase水中,DU800紫外分光光度计检测RNA浓度及纯度,选取OD260/OD280吸光度比值＞1.8的样本保存于-70℃低温冰箱,详细提取步骤可参阅产品说明书。

1.3.2 RT-PCR检测2组组织中miRNA-185表达情况

将提取的miRNA逆转录成cDNA。miRNA-185的序列从Sanger Institute的 miRBase:Sequence数据库查得。其检测步骤为:①在逆转录过程中,采用poly(A)聚合酶给miRNA添加多聚腺苷酸尾巴;②逆转录酶将miRNA和 RNA都转化为cDNA;③PCR:oligo-dT引物在 5′末端带有通用标签,与miScript Universal Primer特异性结合,并与miRNA-specific primer一起以此确保 PCR过程中miRNA的特异性扩增;④将PCR产物进行电泳。本实验采用 U6 RNA作为内参照,根据 miScript ReverseTranscription Kit说明书分别加入RT-PCR反应所需试剂、引物、miRNA样品等进行RT-PCR反应。逆转录条件:37℃60 min,95℃5 min。PCR条件:95℃15 min,94℃15 s,55℃30 s,70℃34 s;40个循环。PCR结果用4%琼脂糖胶上样电泳,电泳照胶仪下观察。将逆转录合成的cDNA作为模板,进行PCR扩增从而准确验证miRNA-185在2组组织中的表达情况。

1.3.3 Rea1-time PCR检测2组组织中miRNA-185表达情况

采用SYBR Green荧光染料法,U6 RNA作为内参照,循环阈值(Ct)比较法进行miRNA表达相对定量分析,从而准确验证miRNA-185在2组组织中的表达情况[4]。以逆转录合成的cDNA为模板,应用 miScript Primer Assay配合 miScript SYBRGreen PCR Kit进行Real-time PCR分析;应用miScript Universal Primer和miRNA-specific primer(miScript Primer Assay)扩增miRNA。Real-time PCR条件:95℃15 min,94℃15 s,55℃30 s,70℃34 s;循环40次,30 L反应体系。随后继续进行建立熔解曲线的反应:95℃变性1 min;在55～95℃的区间内进行熔解实验,即缓慢升温,每个温度1个循环,每个循环30 s,共 40个循环。每管设3个复孔,冰上避光操作。反应结束后,电脑自动得出熔解曲线,结果用ABI自带软件分析。

1.3.4 数据分析

目的基因相对表达量 =2-ΔΔCt,2-ΔΔCt表示的是肾癌组(作为实验)目的基因表达相对于癌旁组(作为对照)变化的倍数。在目的基因与内参基因扩增效率相同的情况下可以直接得到目的基因相对于内参基因的定量[5]。ΔΔ Ct=(Ct目的-Ct内参)实验-(Ct目的-Ct内参)对照,把所得到的CT值还原为目的基因的量,进行对数转换后符合正态分布的规律。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件对实验结果进行分析。计数资料采用χ2检验;相关性分析采用Pearson法,以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

1) RT-PCR电泳结果显示,miRNA-185和U6 RNA均呈单一条带,其所处的位置及其在正常组织和癌组织中的表达情况符合前期的预计(图1),证明相应的实验条件和所设计的引物均符合实验要求。

图1 正常组织和肿瘤组织RT-PCR电泳图

2) Real-time PCR结果显示,Real-time PCR根据所得的熔解曲线可知,miRNA-185及U6 RNA基因扩增产物的熔解曲线峰均为单一峰形,未见其他峰值,并且峰的形状也较锐利,提示无引物二聚体的生成和干扰,获得的PCR产物具有特异性,以此为基础进行定量是可靠的。Real-time PCR得到的ΔΔ Ct通过 2-ΔΔCt可求得目的基因相对表达量 ,结果显示:miRNA-185在肾癌组组织中呈高表达,较癌旁组织平均升高5.14倍。22例标本中有17例(77%)肾癌组组织中 miRNA-185阳性表达率为77.3%(17/22),明显高于癌旁组的22.7%(5/22)(P＜0.05)。肾癌标本中miRNA-185的表达高于其在癌旁正常组织中的表达,表达倍数最大值为29.14,最小值为0.06。

3) G1期的4例肾癌标本均较相应的癌旁正常组织呈现低表达,高表达的则离散分布在G2和G3期。相关性分析结果显示,miRNA-185在肾透明细胞癌组织中的相对表达量与肾癌病理学分期呈正相关(r=0.58,P＜0.05)。

3 讨论

microRNA是一类广泛存在于动植物和人类体内的非编码小分子RNA。成熟的microRNA通常为22个左右的核糖核苷酸组成,在转录后水平通过降解目标mRNA或抑制翻译调节基因表达,在调控基因表达和肿瘤的发生、发展中发挥重要作用。有研究表明,miRNAs在肿瘤的发生与发展过程中既可能起到扮演癌基因,也可扮演抑癌基因的角色[6-8],因此miRNA在恶性肿瘤的发病机制、早期诊断以及寻找新的治疗手段的研究中有着重要的意义。

虽然已经明确miRNAs对肿瘤发展过程中基因表达调控里有重要作用,但对于miRNA在肿瘤和正常组织中表达量的多少还不明确。既往主要采用液相杂交、Nothern blotting检测miRNA,灵敏度不高,且miRNA前体和其基因组均可产生非特异性信号,导致特异性降低[9]。笔者通过poly(A)聚合酶给miRNA添加多聚腺苷酸尾巴,同时,逆转录酶将 miRNA和 RNA都转化为 cDNA,并通过miScript UniversalPrimer与 miRNA-specific primer将其扩增出来,具有高度特异性、实验设计简单、成本低廉及通用性好等优点,可用于检测多种目的miRNA。另外,本实验利用实时定量PCR技术,选择miRNA-185作为研究对象,分析22例肾透明细胞癌手术患者标本中癌组织与癌旁正常组织中miRNA-185的表达情况,并对组织学分期进行纵向比较,找出肿瘤各期miRNA-185的差异,其高表达提示miRNA-185在肾透明细胞癌中很可能具有癌基因作用。

microRNA的发现在2002年被《Science》杂志列为十大科技突破之首[10],而miRNAs在肿瘤的发生、发展中的作用研究是目前热点。尽管已经有很大进步,但在miRNAs与肿瘤特别是泌尿系肿瘤方面之间还有很多问题值得进一步的研究。因此寻找特定的microRNA作为泌尿系统肿瘤诊断的指标、治疗的手段或靶点有可能成为从根本上防治这些疾病的一个新的突破口。

[1]Calin G A,Sevignani C,Dumitru C D,et al.Human miaroRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers[J].PNAS,2004,101(9):2999-3004.

[2]Medina P P,Slack F J.MicroRNAs and cancer:an overview[J].Cell Cy cle,2008,7(16):2485-2492.

[3]Ho J,Ng K H,Rosen S,et al.Podocyte-specific loss of functional microRNAs leads to rapid glomerular and tubular injury[J].J Am Soc Nephrol,2008,19(11):2069-2075.

[4]Schmittgen T D,Lee E J,Jiang J,et al.Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA[J].M ethods,2008,44(1):31-38.

[5]Yuan J S,Reed A,Chen F,et al.Statistical analy sis of real-time PCR data[J].BMC Bioinformatics,2006,7:85.

[6]Esquela Kerscher A,Slack F J.Oncomirs-microRNAs with a role in cancer[J].Nat Rev Cancer,2006,6(4):259-269.

[7]Hammond S M.MicroRNAs as oncogenes[J].Curt Opin Genet Dev,2006,16(1):4-9.

[8]Cho W C.OncomiRs:the discovery and progress of microRNAs in cancers[J].Mol Cancer,2007,6:60.

[9]Wang B,Doench J G,Novina C D.Analysis of microRNA effector functions in vitro[J].Methods,2007,43(2):91-104.

[10]Couzin J.Breakthrough of the y ear.Small RNAs make big splash[J].Science,2002,298(5602):2296-2297.