新疆伊犁部分地区奶牛新孢子虫病血清学调查

何晓杰，苏 娃，王振宝，巴音查汗

（1.伊犁职业技术学院，新疆伊宁 835000；2.伊犁出入境检验检疫局综合技术服务中心，新疆伊宁 835000；3.新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052）

新孢子虫病（Neosporiasis）是由犬新孢子虫（Neospra caninum）引起的一种原虫病，主要寄生于牛、犬、羊等多种哺乳动物细胞内[1-2]，引起牛、犬、羊等动物的神经肌肉性疾病和流产，尤其是奶牛的流产，严重影响养牛业的健康发展。犬新孢子虫病在世界范围内流行，是牛和犬的一种严重疾病[3]。欧洲、美洲、澳大利亚、新西兰等地都有发生，我国周边的日本、韩国等国家和我国台湾地区都有报道，感染率10%～40%，最高可达82%，给养牛业的生产造成巨大的经济损失，严重影响养牛业的发展。于晋海等[4]分别检测了312份来自国内10个省（市、自治区）的牛血清，结果表明，新抱子虫抗体阳性率为34.4%，证明我国奶牛感染新孢子虫病比较普遍。

奶牛可以通过消化道感染犬新孢子虫，犬口服组织包囊后可产生未孢子化的卵囊，卵囊在宿主动物体外24 h可孢子化，奶牛在采食了被新孢子虫卵污染的饲料或饮水后被感染，也可通过哺乳而感染[5]。目前，胎盘感染是唯一被证实的垂直传播途径[6]，使得母畜连续多次怀孕中将新孢子虫传染给胎儿。迄今为止，还没有防治新孢子虫病的有效药物和疫苗，检出病牛后，淘汰牛只及其他辅助措施是当前仅有的防治方法，新孢子虫病的早期诊断对有效控制该病发生和蔓延具有重要意义。新疆伊犁是我国重要的畜牧业生产基地之一，奶牛业发展迅速，为了解伊犁地区是否存在新孢子虫病，本试验采用间接ELISA方法对伊宁市及周边地区的奶牛进行了血清学调查。

1 材料和方法

1.1 抗原、标准血清

新孢子虫地方虫株SRS2重组抗原、标准阳、阴性血清，均由新疆农业大学动物医学学院巴音查汗教授采用新孢子虫新疆株制备，惠赠于伊犁职业技术学院兽医实验室保存。

1.2 待检血清

101份待检血液采自伊宁市及其周边地区的奶牛牛群，其中A养殖户（新源县）30份，B养殖户（昭苏县）21份，C养殖户（巩留县）10份，D养殖户（伊宁县）40份；均空腹、颈静脉采集，采集后摆成斜面，置4℃冰箱5 h，然后放在室温待血清析出后收集血清，于-70℃冰箱中冷冻保存，待检。

1.3 主要试剂

HRP-山羊抗牛IgG抗体购于Sigma公司，其他化学试剂均为国产或进口分析纯。

1.4 主要仪器

iMark型酶标仪购于美国Bio-Rad公司；1575型洗板机购于美国Bio-Rad公司；小型恒温培养箱购于东京理化器械株式会社；酶标板购于上海生工有限公司。

1.5 检测方法

依据巴音查汗教授所建立的奶牛新孢子虫病ELISA检测方法，应用地方虫株SRS2重组抗原对奶牛血清中新孢子虫抗体进行检测。

1.5.1 包被抗原

将新孢子虫地方虫株SRS2重组抗原用50 mM碳酸盐缓冲液（50 mM carbonate-bicarbonate Buffer，pH 9.6）稀释为0.5 μg/mL，混匀后加入96孔酶标板孔里，50 μL/孔，置于4℃过夜。

1.5.2 封闭

吸取洗涤液（0.05%Tween-20的PBS 缓冲液）洗涤，250 μL/孔，洗涤1次后，拍干。加入封闭液（3%脱脂乳的 PBS 缓冲液），100 μL/孔，37℃封闭1 h。

1.5.3 加样

封闭好的酶标板用洗涤液洗涤1次，将待检血清用封闭液按1:100稀释后，每个样品平行加到酶标板的2个孔中，50 μL/孔，置37℃恒温培养箱中培养1 h。同时设阴、阳性血清对照。

1.5.4 加酶标二抗（HRP-山羊抗牛IgG抗体）

将酶标板用洗涤液洗涤6次后，加入以1:4 000稀释的酶标二抗，50 μL/孔，置37℃温箱中温育1 h。

1.5.5 加显色液

洗涤同上。洗涤后，吸取显色液于酶标板中，100 μL/孔。（显色液：0.3 mg/L 的 2，2'-azino-bis，0.1M 柠檬酸、0.2 M 的 PBS 和 0.003%H2O2），室温暗处放置1 h。

1.5.6 读数

用酶标仪测定415 nm条件下的吸光度即OD415nm值，进行读数。

1.5.7 判定标准

ELISA抗体滴度表示成最大稀释度的倒数，两阳性血清对照孔的平均值≥0.1，且两阴性血清对照孔的平均值＜0.1时试验成立，两样品孔OD415nm平均值≥0.1为阳性，＜0.1为阴性。

2 结果

2.1 新疆伊犁部分地区奶牛新孢子虫病血清学调查结果

应用新孢子虫地方虫株SRS2重组抗原对101份伊宁及其周边地区的奶牛血清样品进行ELISA检测，试验结果表明，新孢子虫抗体阳性12份，阳性率为11.9%（见表1）。

从表1可以看出，D养殖户的奶牛群感染新孢子虫比较严重，B养殖户的奶牛群感染率相对比较低。经统计学分析，A、B、C养殖户的奶牛新孢子虫感染率差异显著（P<0.05）；A、C养殖户的奶牛新孢子虫感染率差异显著（P<0.05）；A、D 养殖户和 B、D养殖户的奶牛新孢子虫感染率差异极显著（P<0.01）；C、D 养殖户的奶牛新孢子虫感染率差异不显著（P>0.05）；A、B、C、D 养殖户的奶牛新孢子虫感染率差异不显著（P>0.05）。

2.2 不同年龄奶牛血清中新孢子虫抗体阳性情况

将101份牛血清样品的检测结果，按不同年龄分组进行比较分析。由下表可知，各年龄段的奶牛均可感染牛新孢子虫。经统计学分析，不同年龄段之间的奶牛新孢子虫的感染差异不显著（P>0.05）（见表 2）。

3 分析与讨论

3.1 在宿主和虫体相互作用的过程中，虫体表面蛋白是宿主免疫应答反应的主要目标，并且虫体的表面抗原是最佳的诊断试剂[7]。研究表明，新孢子虫地方虫株表面蛋白SRS2具有较好的免疫原性，是新孢子虫病诊断和疫苗研究的重要候选抗原，与用于血清学诊断的GST NcSAG1t[8]基本相符，因此，认为SRS2重组抗原是检测奶牛血清中新孢子虫抗体的重要诊断抗原之一。

3.2 为进一步了解新疆伊犁地区奶牛新孢子虫病的感染情况，以便于有效控制该病的发生和蔓延，本试验应用新孢子虫地方虫株SRS2重组抗原作为ELISA诊断抗原，对新疆伊犁部分地区进行了新孢子虫病的血清学调查，结果表明，检测的4个养殖户的奶牛群中均不同程度感染了新孢子虫病，平均抗体阳性率为11.9%，总体来说，不同养殖户奶牛的新孢子虫抗体阳性率差异不显著（P>0.05）。同时本试验又对1～3岁，4～6岁，7～9岁三个不同年龄段奶牛的新孢子虫抗体阳性率进行比较分析，发现三个年龄段的奶牛均可感染新孢子虫，并经统计学分析差异不显著。从本次的检测结果来看，初步说明伊宁及周边地区的奶牛牛群中存在新孢子虫病，各种年龄段的奶牛均可感染，应引起重视，加强防范。

3.3 刘晶[9]等利用新孢子虫体外重组表面蛋白dNcSRS2蛋白作为包被抗原，建立了检测新孢子虫血清抗体间接ELISA方法，且与进口的IFAT及两种商品化ELISA试剂盒的检测结果相比较，符合率均达到92%以上，同时对236份奶牛血清的新孢子虫抗体进行检测，阳性率为22%。本试验采用由Chahan B于2003年建立的新孢子虫病ELISA诊断方法[10]，该方法具有敏感性高，特异性好、操作简单、快速，且包被的抗原易于保存，可用于大量血清样品检测等优点，作为有效检测奶牛新孢子虫病的血清学诊断方法之一，在牛新孢子虫病诊断、流行病学调查中已得到广泛应用。

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