化瘀泻浊方对肾间质纤维化实验*大鼠TGF-β1、p-Smad2/3的影响

潘利敏，王凤丽，王彦凯，商亚茹，王月华△

(1.河北省中医院，河北 石家庄 050011;2.石家庄长城体检中心，河北 石家庄 050017)

化瘀泻浊方对肾间质纤维化实验*大鼠TGF-β1、p-Smad2/3的影响

潘利敏1，王凤丽1，王彦凯2，商亚茹1，王月华1△

(1.河北省中医院，河北 石家庄 050011;2.石家庄长城体检中心，河北 石家庄 050017)

目的:观察化瘀泄浊方对肾间质纤维化实验大鼠TGF-β1、p-Smad 2/3的影响。方法:选用健康、雌性 SD大鼠50只，用单侧输尿管结扎方法复制大鼠肾间质纤维化模型，将其随机分为缬沙坦组［给予缬沙坦5.3mg/(kg·d)经口灌服］、化瘀泄浊方组［化瘀泄浊方5.7g/(kg·d)经口灌服］、阿魏酸哌嗪分散片组［给予阿魏酸哌嗪分散片6.7mg/(kg·d)］与模型组［给予同等量生理盐水经口灌服］，并设假手术组，每组10只大鼠。行 HE、Masson染色观察实验大鼠梗阻侧肾脏组织形态学改变并用免疫组化方法检测观察实验大鼠梗阻侧肾脏转化生长因子-β1(TGFβ1)及p-Smad 2/3在蛋白水平的表达。结果:模型组及各治疗组与假手术组相比均呈现程度不同的病理损害，梗阻肾间质TGFβ1、p-Smad 2/3蛋白的表达也增加(P<0.05)。各治疗组与模型组比较，TGFβ1、p-Smad 2/3表达明显减少(P<0.05)。治疗各组间比较，化瘀泄浊方组优于阿魏酸哌嗪分散片组(P<0.05)，其他各组间均无明显差异(P>0.05)。结论:输尿管梗阻后肾组织呈现程度不同的病理损害，肾纤维化面积明显增加，这可能与TGFβ1、p-Smad 2/3表达增加有关，化瘀泄浊方对其有一定的抑制作用。

化瘀泄浊方;单侧输尿管结扎;肾间质纤维化;转化生长因子β1;p-Smad 2/3

肾间质纤维化(tubulointerstitial fibrosis TIF)是各种原因所致肾脏疾病进展至终末期肾功能衰竭的共同病理特征，减轻肾间质纤维化的程度能显著延缓慢性肾脏病向终末期肾病的进展速度。

化瘀泄浊方是我们在临床上用治慢性肾衰的常用方，取得了较好的临床疗效。本实验应用化瘀泄浊方对单侧输尿管结扎(unilateralureteral obstruction UUO)诱导的肾间质纤维化大鼠模型进行干预性治疗，通过观察化瘀泄浊方对实验动物梗阻侧肾脏病理形态学、转化生长因子 β1(transforming growth factor-β1，TGFβ1)及 p-Smad 2/3的影响，探讨化瘀泄浊方对肾间质纤维化的拮抗作用及部分作用机理，为临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选用健康、雌性SD大鼠50只，体质量180g±10g，清洁级，由河北医科大学动物实验中心提供，动物合格证号冀医动管字第703058号。

1.1.2 主要试剂 TGF-β1、p-Smad 2/3抗体由Santa Curz公司提供。

1.1.3 实验用药 化瘀泄浊方由生黄芪30g、生大黄 12g、地龙 12g、丹参 15g、蒲公英 15g、槐花15g、生牡蛎30g、赤芍15g等组成，由河北省中医院药房提供。上药按比例称取后，水煎、过滤、浓缩并装入瓶中密封备用。缬沙坦由诺华公司提供(批号X0538)。

1.2 方法

1.2.1 动物模型和分组 动物随机分为假手术组、模型组、缬沙坦组、化瘀泄浊方组、阿魏酸哌嗪分散片组，每组10只。缬沙坦组给予缬沙坦5.3mg/(kg·d)经口灌服;化瘀泄浊方组给予化瘀泄浊方5.7g/(kg·d)经口灌服;阿魏酸哌嗪分散片组给予阿魏酸哌嗪分散片6.7mg/(kg·d)经口灌服;假手术组和模型组给予同等量生理盐水经口灌服。手术前1d开始给药至实验结束前1d。左侧输尿管结扎术参照文献进行。除假手术组外其余各组均行左侧输尿管结扎术。于实验第21天全部杀检，取左侧肾脏以4%多聚甲醛固定、包埋、切片，行HE及Masson染色进行病理学观察，并采用免疫组化方法检测 TGF-β1、p-Smad 2/3 的表达。

1.2.2 免疫组织化学方法(SABC法) 半定量分析:采用HPIAS-1000型全自动彩色病理图像分析系统，在200倍光镜下采集图像，每例各选15个视野，在光亮度和放大倍数一致的条件下对免疫组化结果进行自动测量，最后取平均值，TGF-β1的结果分析是相对阳性面积=阳性染色面积/视野大小×100%，p-Smad 2/3的结果分析是计算一个视野场中强阳性着色核占小管细胞核总数的百分比。

1.3 统计学处理方法

采用SPSS13.0统计软件包进行统计分析，采用One-Way ANOVA，组间两两显著性比较采用 LSD法，显著性标准为P<0.05。

2 结果

2.1 HE及Masson染色结果

肾组织HE及Masson染色显示，模型组肾间质有大量炎细胞浸润和纤维组织增生，肾小管部分萎缩、管腔闭塞或扩张，肾小球数目明显减少，面积缩小。肾小囊黏连或扩张，小囊周围大量纤维组织增生。其他各治疗组间质可见多少不等的炎细胞浸润，少量纤维组织增生，肾小管轻度扩张，部分肾小球轻度萎缩，小囊扩张，肾小球数量无明显改变。

2.2 各组大鼠肾间质纤维化面积半定量分析结果

表1 各组大鼠纤维化面积及ck蛋白表达半定量分析结果比较(±s)

表1 各组大鼠纤维化面积及ck蛋白表达半定量分析结果比较(±s)

注:与正常组比较:△P<0.01;与模型组比较:□P<0.01;与阿魏酸组比较:○P<0.01

组别n(例数) 纤维化面积(μm2) TGFβ1(%) p-Smad 2/3(%)假 手 术 组872.41± 116.62 19.51±2.81 4.63±0.77模 型 组 8 7830.78±1250.80△ 70.25±2.49△ 32.10±1.73△缬 沙 坦 组 9 4532.72± 639.56△□○ 40.27±3.64△□○ 17.61±1.25△□○化 瘀 泄 浊 方 组 9 4660.27± 991.14△□○ 41.24±3.42△□○ 18.57±1.36△□○阿魏酸哌嗪分散片组 9 5852.09± 900.44△□ 54.93±2.83△□ 24.85±1.57△□F值82.476 338.080 516.131

表1显示，模型组肾间质纤维化程度较重;缬沙坦组、化瘀泄浊方组、阿魏酸哌嗪分散片组与模型组比较，肾间质纤维化面积明显减少(P<0.05)，提示化瘀泄浊方、阿魏酸哌嗪分散片及缬沙坦均有拮抗肾间质纤维化的作用，其中化瘀泄浊方组优于阿魏酸哌嗪分散片组(P<0.05)，其他各组间均无明显差异(P>0.05)。

2.3 TGFβ1蛋白的表达、分布及半定量分析结果

假手术组 TGFβ1蛋白呈弱阳性表达于肾小球内。与假手术组比较，其余各组在肾小管上皮细胞表达显著增强，间质细胞、肾小球内亦有强表达。半定量分析显示，模型组及各治疗组较假手术组TGF-β1的表达呈显著性升高(P<0.01);缬沙坦组、化瘀泄浊方组、阿魏酸哌嗪分散片组与模型组相比，TGFβ1的表达均呈显著性下降(P<0.05)，其中化瘀泄浊方组优于阿魏酸哌嗪分散片组(P<0.05)，其他各组间均无明显差异(P>0.05)。

2.4 p-Smad 2/3蛋白的表达、分布及半定量分析结果

主要表达于小管的上皮细胞核和间质的浸润单核细胞核中。半定量分析显示，模型组及各治疗组较假手术组p-Smad 2/3的表达呈显著性升高(P<0.01);缬沙坦组、化瘀泄浊方组、阿魏酸哌嗪分散片组与模型组相比，p-Smad 2/3的表达均呈显著性下降(P<0.05)，其中化瘀泄浊方组优于阿魏酸哌嗪分散片组(P<0.05)，其他各组间均无明显差异(P>0.05)。

3讨论

3.1 化瘀泄浊方的用药依据

各种慢性肾脏疾病迁延不愈，最终均导致慢性肾衰竭，肾间质纤维化是慢性肾衰竭的主要病理特征。本研究采用单侧输尿管结扎方法为研究肾间质纤维化的典型模型。本病属于中医“淋证”、“腰痛”、“癃闭”、“关格”等范畴，其病因病机有以下几个方面。一是先天异常。肾为先天之本，禀赋于父母之精气，若先天不足，肾精亏虚，则尿管及肾发育异常;二是湿热蕴结。外邪入侵，郁而化热，蕴结于肾与膀胱;或内热下移，湿热互结，膀胱气化不利，水液内停;三是瘀血络阻。久病多瘀，血不利则病水，瘀血阻滞，尿路不畅，水湿郁结于内;或瘀血内阻，气滞血瘀，阻塞尿路。总之，本病是以湿热、瘀血、络阻等为基本病机，且相互转化，相互影响。本实验以化瘀泄浊中药对单侧输尿管结扎诱导的肾间质纤维化大鼠模型进行干预性治疗，符合上述病机具有可行性。方中丹参、赤芍、大黄、地龙活血通络，化瘀泄浊;蒲公英、槐花清热利湿，解毒泄浊;加用生牡蛎软坚散结;生黄芪益气，且黄芪益气有走而不守之性，所以本品益气不仅可以扶正固本，又可以助丹参、地龙等行血消瘀通络祛邪治标。诸药相伍通补并用、标本兼顾，故成为我们临床用于延缓肾脏病发展进程的基础方。

3.2 化瘀泄浊方的作用机理探讨

肾小管间质纤维化(renal tubulointerstitial fiborsis)是多种慢性肾脏疾病如慢性肾炎、慢性肾盂肾炎、狼疮性肾炎、糖尿病肾病等发展到终末期肾衰的共同途径，它以过量细胞外基质在肾间质积聚及肾间质成纤维细胞增生为特征，众多细胞因子参与该过程，如转化生长因子 β1(transform growth factorβ1，TGFβ1)。近年发现，Smads 蛋白是 TGFβ1家族信号从受体到核的细胞内转导分子，TGFβ1/Smad通路是公认的纤维化过程中的重要通路，其下游分子Smad 2/3的磷酸化代表了该通路的激活。Smad2、3为受体激活型蛋白，与 TGF-β的 I型受体结合形成受体复合物，在磷酸化后从受体复合物上释放出来，与胞浆内的Smad4结合形成低聚体复合物，转移到细胞核内激活核内细胞外基质成分，如各型胶原等启动子的活性，从而细胞外基质合成增加。因此，我们通过观察 TGFβ1和磷酸化 Smad 2/3(p-Smad 2/3)的表达，探讨化瘀泄浊方对肾间质纤维化的作用。本实验结果显示，化瘀泄浊方能减轻肾脏病理损害，减少纤维化面积，抑制肾组织 TGFβ1、p-Smad 2/3蛋白的表达，从而延缓病变肾组织纤维化进程。

△通讯作者:王月华，女，副主任医师，医学博士，从事中西医结合肾病的临床及实验研究。

R285.5

B

1006-3250(2010)09-0775-02

河北省中医药管理局资助项目(2008022，2009028)

2010-02-17

潘利敏(1970-)，女，副主任医师，医学硕士，从事中西医结合肾病的临床及实验研究。