红景天对卒中后抑郁大鼠海马细胞因子干预作用的实验研究*

隋汝波，张 磊，臧丽娥

(1.辽宁医学院附属第一医院 神经内科，辽宁 锦州 121001;2.辽宁医学院，辽宁 锦州 121001)

红景天对卒中后抑郁大鼠海马细胞因子干预作用的实验研究*

隋汝波1△，张 磊2，臧丽娥1

(1.辽宁医学院附属第一医院 神经内科，辽宁 锦州 121001;2.辽宁医学院，辽宁 锦州 121001)

目的:探讨红景天对卒中后抑郁(post-stroke depression，PSD)大鼠海马细胞因子的干预作用。方法:各组进行行为学观察和测试、海马组织HE染色及TNF-α、IL-1β、IL-6含量测定。结果:与PSD组比较，红景天低、中、高剂量组均能不同程度减少海马组织TNF-α、IL-1β含量而提高IL-6的含量，减少海马神经细胞的受损程度，提高抑郁的行为学评分。其中，中、高剂量组较低剂量组作用更明显。结论:PSD大鼠海马组织细胞因子网络稳态发生改变，红景天对PSD大鼠海马有保护作用。

卒中后抑郁;海马;细胞因子;红景天

PSD是脑卒中后的一个常见的并发症，显著增加了卒中患者的病死率、致残率，降低了患者的生存质量，给患者及其家庭乃至社会带来了十分沉重的负担，已越来越引起学者的关注。目前虽已有各种药物用于临床，但疗效均不理想，无效率仍高达20%～40%［1］。近年的研究提出海马损伤及炎症因素参与了PSD的发生发展，故如果能减少PSD时的海马损伤及稳定细胞因子网络，将能够有效治疗PSD。

红景天已有多年临床应用经验，在治疗缺血性心脏病及缺血性脑血管病等方面已取得了良好疗效。对其在 PSD中的作用国内报道少见，而其对PSD时海马组织细胞因子的影响更尚未见报道。本文根据红景天免疫双向调节功能的中医理论，观察其对大鼠PSD时海马组织细胞因子 TNF-α、IL-6及IL-1β水平的影响，以及海马组织的改变及其对PSD大鼠行为学的影响，从而为PSD的治疗提供新的思路及理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选用健康普通级雄性SD(Sprague-Dawley，SD)大鼠 60 只，体重 180g～240g，辽宁医学院实验动物中心提供，许可证号 SCXK(辽)。

1.1.2 药品和试剂 红景天购于吉林白山市药材责任有限公司，IL-1β、TNF-α、IL-6试剂盒购自天津千叶生物技术有限公司。

1.1.3 仪器 DH-I型动物人工呼吸机:浙江医科大学仪器试验厂;低速离心机:北京医用离心机厂;BH6018型四探头自动r计数器:北京核仪器厂;电子天秤:上海天平仪器厂;连续变倍体视显微镜160x:桂林仪器厂;石英自动双重纯水蒸馏器:江苏丹阳门石英玻璃厂;LEICA-RM-2135石蜡切片机:德国;烘片、烤片机:孝感市电子仪器厂;OLYMPUS万能显微镜:日本;CIAS-1000型 T图像分析仪:北京大恒图像视觉有限公司;电热干燥箱:余姚工业仪表二厂。

1.2 方法

1.2.1 分组 遵循随机原则，将72只大鼠分为单纯缺血组、PSD组、氟西汀组和3个剂量的红景天组，每组12只。红景天组红景天分别按生药2.5g/kg/d、5g/kg/d、7.5g/kg/d 溶于 2 ml生理盐水中，灌胃给药21d，余各组每天以同样给药途径给予等剂量的生理盐水，灌胃21d。

1.2.2 大鼠局灶性脑缺血模型的建立［2］

(middle cerebral artery occlusion，MCAO)手术前 12h禁食不禁水。选用标准大鼠麻醉剂量，以10%水合氯醛3ml·kg－1，经腹腔麻醉，仰卧固定于手术台上，颈部正中切开皮肤及浅筋膜，钝性分离胸锁乳突肌与胸骨舌骨肌，暴露左侧颈总动脉(CCA)和迷走神经、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)、ICA的颅外分支——翼腭动脉，在近心端结扎 CCA，在颈总动脉分叉处结扎ECA，结扎翼腭动脉。将ICA远心端用动脉夹夹闭，距颈总动脉分叉处近心端0.5cm处将颈总动脉剪一小口，插入备好的碳素鱼线，去除动脉夹，沿着ICA轻轻向前推进，注意不要误入翼鄂动脉，当到达指定长度(18 mm左右)时结扎ICA并固定鱼线。假手术组动物，除手术过程中不插入线栓以外，其他过程相同。以青霉素局部消毒后缝合皮肤，术后保持环境温度在25℃ ～30℃左右。尤其要注意动物头部的保温。模型成功的标志是大鼠即刻出现右侧Horner征。

1.2.3 大鼠卒中后抑郁模型的制备 CUMS:按willner和 Katz方法:①禁食禁水 20h;②禁水17h;③倾斜鼠笼45°17h;④持续光照17h;⑤湿笼(100g锯屑+200ml水)21h;⑥4℃游泳 5min;⑦水平摇晃5min;⑧行为限制2h;⑨夹尾1min 9种刺激每天随机采取1种共21d;⑩孤养:将PSD和抑郁组动物单笼饲养。

1.2.4 行为学观察和测试 CUMS后第1、7、14、21天行旷野实验测试，每周行蔗糖水实验并测量体重。(1)旷野实验:室内隔音，测定5min水平及垂直运动得分;(2)蔗糖水实验:20h禁食禁水后，测定1h糖水饮用比例(糖水消耗/总液体消耗 ×100%);(3)体重测量:每周测量各组体重。

1.2.5 HE染色 大鼠以10%水合氯醛(0.3ml.100mg－1)腹腔注射麻醉，打开颈部暴露颈右总动脉，插管，先输注生理盐水约50ml，然后输注4%多聚甲醛约50ml，断头取脑。甲醛固定，冠状脑片制备，选择梗死中心(即最大层面)，常规酒精脱水，石蜡包埋，制成 4μm ～6μm 厚的切片，附片，行苏木素-伊红(HE)染色，分别观察梗死中心区、梗死周边区脑组织(海马CAl、CA3区)，前述区域神经细胞和血管内皮细胞(每个观察区选择具有代表性标本观察结果并记录)。

1.2.6 放射免疫法检测海马组织IL-1β、TNF-α、IL-6的含量 21d后各组每只分别迅速断头，剥离出脑，在冰浴下迅速分离海马组织，制备组织匀浆，3000r/min离心15min，吸取上清液采用放射免疫分析法检测细胞因子，实验按说明书操作。

1.2.7 统计学处理 实验数据计量资料均用均数±标准差(±s)表示，采用SPSS16.0统计软件进行单因素方差分析。P<0.05为差异有显著性，P<0.01为差异非常显著。

2 结果

2.1 大鼠行为学观察和测试

表1 各组PSD大鼠体重比较(±s，g)

表1 各组PSD大鼠体重比较(±s，g)

注:经方差分析与两两比较，与假手术组比较:aP>0.05，bP<0.01，cP<0.05;与单纯缺血组比较:dP>0.05，fP<0.01;与 PSD组比较:eP<0.05，gP>0.05，iP<0.01;与低剂量组比较:jP>0.05，kP<0.05，lP<0.01;与氟西汀组比较:nP>0.05，rP<0.05;与中剂量组比较:mP>0.05

组别第1天 第7天 第14天 第21天假 手 术 组 278.7±22.5 279.6±23.8 293.7±20.9 304.6±25.8单 纯 缺 血 组 279.4±28.3a 289.7±26.2a 307.5±27.2b 311.4±26.6c PSD 组 284.5±23.2d 285.9±25.1d 266.1±12.1f 261.0±21.7f氟 西 汀 组 281.3±21.3g 281.0±21.5g 297.2±26.3i 311.2±22.1i红 景 天 低 剂 量 组 278.5 ±27.4g，n 279.4 ±20.3g，n 281.3 ±23.7e，r 285.2 ±31.7e，r红 景 天 中 剂 量 组 279.7 ± 23.7g，j，n 280.0 ± 30.9g，j，n 296.8 ± 21.5i，k，n 306.9 ± 27.5i，k，n红 景 天 高 剂 量 组 281.6 ± 20.6g，j，n，m 279.7 ± 25.9g，j，n，m 295.1 ± 23.5i，l，n，m 310.8 ± 22.9i，l，n，m

表2 各组PSD大鼠糖水消耗量比较(±s，ml)

表2 各组PSD大鼠糖水消耗量比较(±s，ml)

注:经方差分析与两两比较，与假手术组比较:bP<0.05，cP>0.05;与单纯缺血组比较:fP<0.01;与 PSD组比较:gP>0.05，eP<0.05，iP<0.01;与低剂量组比较:jP>0.05，hP<0.05，lP<0.01;与氟西汀组比较:nP>0.05，rP<0.05;与中剂量组比较:mP>0.05

组别第1天 第7天 第14天 第21天假 手 术 组39.4±5.5 40.6±4.3 38.6±4.7 38.8±4.6单 纯 缺 血 组 34.6±8.5c 38.3±6.2c 35.6±4.3c 30.3±4.4b PSD 组 23.7±6.3f 20.5±3.9f 17.6±9.0f 10.5±3.4f氟 西 汀 组 23.9±4.5g 25.2±5.2g 31.1±6.3e 33.2±3.6i红 景 天 低 剂 量 组 22.4 ±4.9g，n 23.0 ±6.5g，n 25.6 ±2.6e 27.6 ±7.7i，n红 景 天 中 剂 量 组 23.7 ± 2.6g，j，n 25.0 ± 7.9g，j，n 29.8 ± 6.5e，h，n 34.9 ± 3.5i，l，n红 景 天 高 剂 量 组 22.6 ± 5.0g，j，n，m 24.7 ± 3.5g，j，n，m 30.1 ± 6.2e，h，n，m 32.8 ± 4.9i，l，n，m

表3 各组PSD大鼠旷野实验水平运动得分比较(±s，次/5min)

表3 各组PSD大鼠旷野实验水平运动得分比较(±s，次/5min)

注:经方差分析与两两比较，与假手术组比较:cP<0.01;与单纯缺血组比较:fP<0.01;与 PSD组比较:gP>0.05，iP<0.01;与低剂量组比较:jP>0.05，lP<0.05，kP<0.01;与氟西汀组比较:nP>0.05，rP<0.05;与中剂量组比较:mP>0.05

组别第1天 第7天 第14天 第21天假 手 术 组51.3±4.5 6.4±3.1 58.2±2.9 59.6±5.2单 纯 缺 血 组 43.4±7.5c 48.3±4.2c 44.6±5.3c 41.3±4.6c PSD 组 29.7±2.3f 23.5±2.3f 19.6±1.9f 15.5±2.4f氟 西 汀 组 28.3±3.2g 28.9±3.2g 39.3±2.1i 39.1±1.3i红 景 天 低 剂 量 组 27.4 ± 2.6g，n 28.0 ±1.9g，n 29.6 ±2.1i，r 30.6 ± 1.7i，r红 景 天 中 剂 量 组 28.7 ± 1.6g，j，n 29.4 ± 3.0g，j，n 38.8 ± 0.5i，l，n 38.9 ± 1.5i，k，n红 景 天 高 剂 量 组 27.6 ± 4.6g，j，n，m 28.7 ± 0.5g，j，n，m 36.1 ± 2.5i，l，n，m 37.8 ± 2.6i，l，n，m

表1～3显示，与单纯缺血组相比，PSD组大鼠体重和糖水消耗量下降，水平运动及垂直运动水平降低(P<0.01);氟西汀组大鼠体重和糖水消耗量增多，水平运动及垂直运动水平提高(P<0.01);红景天各组均可以增加PSD大鼠体重和糖水消耗量，提高水平运动及垂直运动水平，其中中、高剂量组较低剂量组效果更明显 (P<0.01)，但2组间无明显差异(P>0.05)。且中、高剂量红景天组与氟西汀组相比，无明显差异(P>0.05)。

2.2 海马CA1区脑组织病理形态学

HE染色(×400)光学显微镜下观察，每组均可见正常神经元和损伤神经元。正常神经元核圆形，边界及核仁清楚;损伤神经元胞核肿大、偏位，核仁消失，胞浆着色浅、苍白或核浓缩、深染，细胞呈三角形缺血性坏死变化。损伤神经元上述特点在PSD组表现得最明显;红景天组与氟西汀组均能不同程度地改善神经细胞的核深染、核固缩程度，减少细胞及间质的水肿，使胞膜清楚、形态正常、核仁清晰可见的神经细胞数目增多。

2.3 海马组织 TNF-α、IL-1β、IL-6的含量

表4显示，与单纯缺血组相比，PSD组 TNF-α、IL-1β含量明显增加而 IL-6的含量下降，差异有统计学意义(P<0.01);与PSD组相比，氟西汀组与红景天各组均降低 TNF-α、IL-1β的含量而提高 IL-6含量(P<0.01);其中，中、高剂量组较低剂量组效果更明显(P<0.05)，2组间无明显差异(P>0.05)。而中、高剂量红景天组与氟西汀组相比，无明显差异(P>0.05)。

表4 各组PSD大鼠海马组织细胞因子含量比较(±s，)

表4 各组PSD大鼠海马组织细胞因子含量比较(±s，)

注:经方差分析与两两比较，与假手术组比较:bP<0.05，与单纯缺血组比较:fP<0.01;与 PSD组比较:iP<0.01;与低剂量组比较:kP<0.05，lP<0.01;与氟西汀组比较:nP>0.05，rP<0.05;与中剂量组比较:mP>0.05

组别 TNF-α(ng/ml) IL-1β(pg/ml) IL-6(pg/ml)假 手 术 组0.69±0.3 0.17±0.4 152.50±3.7单 纯 缺 血 组 0.95±0.1b 0.28±0.1b 121.80±7.7b PSD 组 1.66±0.3f 0.83±0.2f 80.30±5.9f氟 西 汀 组 1.02±0.3i 0.32±0.4i 138.40±6.2i红 景 天 低 剂 量 组 1.27 ± 0.1i，r 0.62 ± 0.6i，r 113.60 ± 5.8i，r红 景 天 中 剂 量 组 1.15 ± 0.5i，l，n 0.48 ± 0.3i，l，n 128.90 ± 1.5i，k，n红 景 天 高 剂 量 组 1.09 ± 0.2i，l，n，m0.37 ± 0.5i，l，n，m 137.80 ± 0.9i，l，n，m

3 讨论

3.1 PSD的发病机制仍不明确，多种学说并存

研究证实，中度抑郁患者海马体积减少，并可被抗抑郁药逆转，从而提出了海马神经再生障碍假说。近年来有研究显示，细胞因子网络的异常有可能参与PSD的发生。多项实验证明，IL-6延迟性表达对缺血再灌注后海马神经元有保护作用，抑制IL-1β及TNF-α的合成，对抗谷氨酸引起的细胞损伤。而TNF-α及IL-1β对缺血再灌注后海马神经元有损伤作用，具体机制还需进一步研究。以卒中后炎症反应为基础，最近Robinson等提出了关于PSD病因学的新假说，即细胞因子假说。他们认为，细胞因子与5-HT通过吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO酶)的相互作用可能在PSD中起重要作用:卒中后炎性细胞因子(如IL-1β，TNF-α)增多导致炎症过程的增强(尤其是边缘区)和IDO酶的广泛激活，并继发旁边缘结构如前侧额皮质和基底节的5-HT的耗竭。Tara等在大鼠模型中的研究发现，侧脑室灌注IL-1受体拮抗剂(IL-1ra)可以逆转大鼠的 PSD样行为，表明PSD可能涉及脑内IL-1传递的改变。与单纯卒中相比，PSD患者可能有致炎性细胞因子水平的进一步升高或高峰持续时间延长，或抗炎性细胞因子水平的降低或反应性升高的延迟，即PSD患者体内可能存在着细胞因子网络稳态的失衡。给予抗炎性细胞因子或抗抑郁治疗后，患者可能出现炎性细胞因子水平降低或抗炎性细胞因子水平升高，细胞因子网络重新达到稳态，进而减少对海马的损伤，改善患者抑郁症状。

3.2 红景天是近年来新开发的高山药用植物，已有多年临床应用经验，在治疗缺血性心脏病及缺血性脑血管病等方面已取得了良好疗效

文献报道，它能在极其恶劣而多变的自然环境中生长，具有扶正固本、益气化瘀、抗缺氧、增强免疫功能及双向调节等功效。已证实，红景天内含 Cu-Zn-SOD与Mn-SOD，是重要的超氧自由基清除剂，直接提供并增加SOD水平。它能促使血管内皮细胞产生NO，有效抑制ADP诱导的血小板聚集，改善血小板功能，恢复纤溶活性，抗体外血栓形成。而其强大的免疫双向调节功能又为其直接降低某些致炎性细胞因子水平，增加抗炎性细胞因子水平，从而稳定细胞因子网络提供了理论上的可能依据。

3.3 本实验研究着眼于对PSD大鼠行为学的观察和测试、海马组织 TNF-α、IL-1β、IL-6含量的测定及海马CA1区病理形态学的观察

与单纯缺血组相比，PSD时海马损伤与细胞因子网络改变显著增加。红景天各组均可以明显改善PSD的抑郁行为学特征及海马组织神经元损伤程度，显著减低海马组织的细胞因子 TNF-α、IL-1β水平，而同时提高 IL-6的含量。上述改变尤以中、高剂量红景天组显著，可以说明红景天对PSD具有保护作用。红景天降低细胞因子水平的作用机制不明，可能与其免疫双向调节功能有关，即维持体内免疫系统处于平衡状态:既能提高免疫功能，又能防止免疫系统的矫枉过正，从而稳定细胞因子网络的平衡;既阻止致炎性细胞因子的过度生成，同时又防止抗炎性细胞因子的过度减少。通过稳定细胞因子网络的平衡，进而减少海马组织的损伤，达到治疗PSD的目的。

［1］江开达.抑郁障碍防治指南［M］.北京:北京大学医学出版社，2007.1-6.

［2］陈佳俊，石岩殊，韩雪梅，等.线拴法大鼠局灶性脑缺血模型(PMCAO)的实验研究［J］.吉林医学，2004，25(10):16-17.

R285.5

B

1006-3250(2010)09-0816-03

辽宁省教育厅高等学校科学研究项目(2008406)

2010-03-08

隋汝波(1971-)，男，副主任医师，医学硕士，硕士研究生导师，从事脑血管病方面的研究。

△通讯作者:隋汝波。Tel:13940653533，E-mail:suirubo 521@yahoo.com.cn。