格林巴利综合征相关及单纯腹泻相关空肠弯曲菌细胞毒作用分析*

孟凡亮,张茂俊,何利华,张建中

格林巴利综合征相关及单纯腹泻相关空肠弯曲菌细胞毒作用分析*

孟凡亮,张茂俊,何利华,张建中

目的分析格林-巴利综合征(GBS)相关空肠弯曲菌细胞毒素(CDT)作用。方法9株GBS相关空肠弯曲菌以及4株腹泻患者分离菌株的全菌蛋白分别以0.001 μ g～ 5μ g/mL的浓度作用于HeLa细胞,通过观察细胞形态的改变,获得不同菌株对细胞作用的差异。结果不同菌株间产生细胞毒作用的浓度范围从0.01μ g/mL到5μ g/mL。结论GBS相关菌株对HeLa细胞的细胞毒素作用与腹泻患者分离株相比没有显著差异。不同空肠弯曲菌菌株对HeLa细胞的细胞毒素作用具有菌株特异性。

空肠弯曲菌;细胞毒素;HeLa细胞

空肠弯曲菌(Campy lobacter jejuni,C.jejuni)是主要导致人类腹泻的弯曲菌属的一个种〔1〕。空肠弯曲菌感染导致的人类疾病称为空肠弯曲菌病,世界卫生组织(WHO)将空肠弯曲菌病列为27种新发传染病之一。空肠弯曲菌病的主要症状是腹泻性肠炎。除肠炎外,空肠弯曲菌的感染与GBS密切相关,是导致GBS的主要病因之一〔2〕,感染了GBS相关的空肠弯曲菌,疾病负担增加。细菌的细胞毒性作用与细菌的致病力密切相关,研究发现空肠弯曲菌菌株的细胞毒素作用与菌株感染后导致的临床结果有关,细胞毒素作用强的菌株导致的临床症状明显严重〔3-4〕。为进一步了解空肠弯曲菌尤其是GBS相关的空肠弯曲菌的细胞毒素作用特征,本研究利用细菌细胞相互作用模式,对9株背景资料清晰的格林-巴利综合征相关空肠弯曲菌菌株以及4株腹泻相关菌株作用于Hela细胞,通过Hela细胞的形态变化特点,初步分析了13株空肠弯曲菌对细胞的相关毒素作用。

1 材料与方法

1.1 材料 细菌:本科室保存的13株空肠弯曲菌(9株从GBS病人分离,4株从腹泻病人分离,菌株的背景及相关生物特征见表1)。以菌株81-176作为阳性对照、幽门螺杆菌J99为阴性对照。细胞:HeLa细胞,由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所腹泻病研究室赠。空肠弯曲菌培养液:细菌培养基为哥伦比亚琼脂(OXOID M0331),细胞培养基为RPMI1640培养基(GIBCO)、胎牛血清(GIBCO)、Trypsin-EDTA(GIBCO)。

表1 空肠弯曲菌菌株背景及对HeLa细胞的最小作用浓度Table 1 Background of C.jejuni strains and minimum concentration on HeLa cells

1.2 方法

1.2.1 细菌培养 复活保存的空肠弯曲菌,取单菌落菌株转种于含10%羊血的哥伦比亚琼脂,微需氧条件(5%O2,10%CO2,85%N2)37℃培养24h。

1.2.2 全菌裂解液收集 收集细菌,用PBS(pH 7.4)洗2遍(4 000g离心,4℃,5min),将沉淀菌体重悬于2 mL PBS中超声破碎(4s×10),12 000 r/min离心 10min,上清用0.22μ m 除菌过滤。BCA法检测蛋白浓度后分装,-80℃保存备用。

1.2.3 HeLa细胞的培养 复苏HeLa细胞,用10%FBS-1640培养基,置于二氧化碳孵箱,37℃培养2～3d后,用Trypsin-EDTA消化后转到24孔细胞培养板,2×104cells/孔,培养24 h,细胞毒素作用前2h换为1.5%FBS-1640培养基。

1.2.4 全菌蛋白细胞毒性检测 分别将5μ g/mL、1μ g/mL 、0.1μ g/mL 、0.01μ g/mL 和 0.001μ g/mL不同浓度的细菌全菌蛋白裂解液与HeLa细胞共同培养,连续观察细胞形态改变(细胞发生肿胀,变大,形状变得不规则,最后破裂)。当50%以上的细胞形态发生改变时,确定为该菌蛋白的最小作用浓度。比较不同菌株最低作用浓度的差异(μ g/mL),PBS作为空白对照。

2 结 果

空肠弯曲菌全菌蛋白作用于HeLa细胞后,细胞发生肿胀、变大、形状变得不规则、最后破裂(图1)。不同浓度的细菌裂解液作用于HeLa细胞,细胞形态变化不同,相同菌株随着蛋白浓度的增加,细胞变化强度增加。不同菌株作用于HeLa细胞后导致细胞形态发生变化的的最小作用浓度(50%以上细胞形态发生改变)不同(表1)。实验结果显示CJGBLC株空肠弯曲菌细胞毒性较弱,浓度为5 μ g/mL时,对HeLa细胞未产生明显的细胞毒性作用(图1-D);阳性对照株81-176在浓度为0.01 μ g/mL时仍对HeLa细胞产生细胞毒性作用(图1-C);阴性对照幽门螺杆菌 J99在浓度为 5 μ g/mL时对HeLa细胞无明显细胞毒性作用。

3 讨 论

图1 空肠弯曲菌全菌蛋白作用于HeLa细胞后,细胞形态变化(图片用Olympus BX51显微镜拍摄,100×)Fig.1 Morphologic change of HeLa celles after treated with whole cell lysis of C.jejuni strains

西方发达国家中,空肠弯曲菌的感染位于食源性感染的首位,是主要的食品安全监测病原。我国自上世纪80年代第一次分离出空肠弯曲菌后,全国各地都有关于空肠弯曲菌的报导。随着我国经济的发展和国民生活模式的改变,我国空肠弯曲菌的感染也越来越受到国家疾病预防控制工作的重视。空肠弯曲菌感染后导致的临床症状是腹泻性肠炎,同时患者伴有发热,头疼,腹痛,恶心,呕吐等症状。空肠弯曲菌肠炎分为轻、中、重型。空肠弯曲菌的致病机制不是很清楚,但菌株的脂多糖成分,菌株的黏附定植能力以及菌株的活动力等皆与菌株的致病机制相关。目前研究发现空肠弯曲菌感染后导致的临床表现与菌株的细胞毒性有关。细胞溶涨毒素CDT(cytolethal distending toxin,简称 CDT)〔5-6〕是目前研究证明空肠弯曲菌的唯一细胞毒素,本次研究应用CDT基因皆为阳性,血清型不同的,来源于GBS患者的9株空肠弯曲菌和来源于腹泻病患者的4株空肠弯曲菌,比较了其对HeLa细胞的细胞毒素作用。结果发现,不同菌株细胞毒作用的最低作用浓度有显著差异。菌株81-176的细胞毒作用最强,最小作用浓度为0.01 μ g/mL。13株空肠弯曲菌中,10株的最小作用浓度相同,皆为 0.1 μ g/mL。其中菌株CJ-GBLC的最小作用浓度最高,是其它菌株的50倍多,表明其细胞毒素作用远远小于其它菌株。与对照阳性菌株81-176相比,空肠弯曲菌菌株间细胞毒性作用可以相差500倍。

本次研究结果表明,空肠弯曲菌的细胞毒作用与菌株的血清型没有显著的相关性。GBS相关菌株与普通腹泻相关菌株比,其细胞毒素作用没有显著差异。即使菌株CDT基因阳性,空肠弯曲菌不同菌株的细胞毒作用可以相差较大。是不同菌株CDT的含量或毒性差异,还是除CDT外,空肠弯曲菌存在其它细胞毒素决定因子,有待进一步分析。

〔1〕M oore JE,Corcoran D,Dooley JS,et al.Campylobacter〔J〕.Vet Res,2005,36(3):351-382.

〔2〕张茂俊,张建中.空肠弯曲菌病与格林巴利综合征〔J〕.中华流行病学杂志,2008,29(6):618-621.

〔3〕Bang D D,Schuetsz F,Ahrens P,et al.Prevalence of cytolethal distending toxin(CDT)genes and CDT production in Campylobacter SPP isolated from Danish broilers〔J〕.Journal of medical microbiology,2001,50(12):1087-1094.

〔4〕Yamano R,Ohara M.Prevalence of cytolethal distending toxin production in periodontopathogenic Bacteria〔J〕.Journal of Clinical Microbiology,2003,41(4):1391-1398.

〔5〕Coote J G,Stewart-tull D E,Owen R J,et al.Comparison of virulence-associated in vitro properties of typed strains of campylobacter jejuni from different sources〔J〕.J Med Microbile,2007,56:722-732.

〔6〕谢龙山,蔡方成.Penner 19空肠弯曲菌毒素的细胞毒性作用研究〔J〕.中华儿科杂志,2002,40(5):283-287.

Cytotoxic effect of Guillain-Barre syndrome-associated and diarrhea-associatedCampylobacter jejuni

MENG Fan-liang,ZHANG Mao-jun,HE Li-hua,ZHANG Jian-zhong

(National Institute of Communicable Disease Control and Prevention,Chinese Center for Disease Control and Prevention,Beijing102206,China)

In order to assess the cytotoxin effect ofCampylobacter jejuni(C.jejuni),the whole cell lysates from 9 strains of Guillan-Barre Syndrome(GBS)-associatedC.jejuniand 4 strains of diarrhea-associatedC.jejuniwere co-cultivated with HeLa cells at the concentration of 0.001-5.00μ g/mLin vitro.The morphologic change of HeLa cells was observed under Olympus BX51 microscope after treatment with different concentration of bacteria lysate in the following 4 days.The morphological changes including swelling,irregularity and lysis of the affected cells over 50%was selected as the cut off for positive change andC.jejuni81-176 andHelicobacterJ99 strains were chosen as the positive and negative control.It was found that the minimum concentration to induce the positive changes in 10 strains(8 GBS associated and 2 strains from diarrhea patients)was 0.1μ g/mL and 1 strain with the positive change at the minimum concentration of 1 μ g/mL.There was only one GBS-associated strain causing no morphologic change on HeLa cells at the concentration of 5μ g/mL.It was evident that the cytotoxic effect ofC.jejunistrains on HeLa cell was strain-specific,and there was no significant difference in the cytotoxic effect on HeLa cell between GBS-associated and diarrhea associatedC.jejunistrains.

Campylobacter jejuni;cytotoxic effect;HeLa cell

R331

A

1002-2694(2010)01-0010-03

*十一五国家科技支撑计划课题(2006BAK02A15-2)

张建中,Email:zhangjianzhong@icdc.cn

中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,北京102206

2009-06-11;

2009-10-09