猪链球菌2型福建分离株的主要毒力基因分析*

方勤美,黄绍谦,俞伏松,朱继昌,林天龙

猪链球菌2型福建分离株的主要毒力基因分析*

方勤美,黄绍谦,俞伏松,朱继昌,林天龙

目的为了解福建地区猪链球菌2型菌株毒力因子分布情况。方法选取谷氨酸脱氢酶(gdh)、荚膜多糖(cps)、溶菌酶释放蛋白(mrp)、胞外因子(ef)、溶血素(sly)、纤连蛋白/血纤蛋白原结合蛋白(fbps)及毒力相关序列orf2等7个猪链球菌2型主要毒力基因,分别设计了7对引物,采用PCR方法,对本室分离保存的猪链球菌2型福建分离株的毒力基因进行分析。结果从屠宰生猪体内分离的4个猪链球菌2型菌株和SS2PFJ07株基因型为gdh+/cps2J+/mrp+/ef-/sly-/fbps+/orf2+,另1株从生猪体内分离的分离菌株基因型为gdh+/cps2J+/mrp+/ef+/sly+/fbps+/orf2+。结论福建地区生猪中猪链球菌2型至少有两种毒力基因型。

猪链球菌2型;福建分离株;毒力基因

猪链球菌2型是一种重要的人兽共患病病原,不同的猪链球菌2型菌株的致病力存在明显差异,而这种差异可能与各菌株的毒力因子分布情况有很大关系〔1〕。国内外许多学者对猪链球菌2型的毒力因子分布与致病力之间的关系进行了研究。目前认为猪链球菌2型的毒力因子主要包括谷氨酸脱氢酶(GDH)、荚膜多糖(CPS)、溶菌酶释放蛋白(MRP)、胞外因子(EF)、溶血素(SLY)、纤连蛋白/血纤蛋白原结合蛋白(FBPS)及毒力相关序列ORF2等。本研究选取了7对主要毒力基因引物进行PCR检测,以了解福建无症状生猪猪链球菌2型的毒力因子的分布情况,并与国内毒力因子表型分布情况作比较,对福建分离株的基因型分布情况作初步分析。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 PFJ07分离自病猪淋巴结,PFJ080820和PFJ080842分离自无症状生猪扁桃体,PFJ080913、PFJ080942和PFJ080943分离自无症状生猪鼻咽拭子,上述菌株经本室2008年9月分离鉴定后保存。猪链球菌2型参考菌株(JA070109)由南京农业大学动物医学院陆承平教授惠赠。

1.2 培养基及试剂 THB液体培养基和绵羊血平板购自广东环凯微生物科技有限公司,ExTaq酶、dNTP、DNA Marker(DL-2000)、蛋白酶 K 均购自TaKaRa公司,细菌基因组DNA抽提试剂盒购自上海生物工程有限公司。

1.3 主要仪器PCR仪(Eppendorf,AG22331),台式离心机(Thermo,PICO17),核酸电泳仪(Hoefer,HE33),自动凝胶成像系统(BIO-RAD,Gel DOC2000)。

1.4 引物合成 参照文献〔2〕合成7对引物,其序列、退火温度及扩增片度大小见表1,各引物均由大连宝生物工程有限公司合成。

表1 PCR反应引物及目的片段大小Table 1 The primer sequences and product size

1.5 模板制备 保存菌株先接种绵羊血平板,置37℃培养18 h后,挑取单菌落接种于THB液体培养基,37℃静置培养18 h。取各检测菌种新鲜培养菌液1 mL离心弃上清,按照试剂盒说明书进行操作提取模板DNA,分装,置-20℃备用。

1.6 PCR反应体系 PCR扩增均采用25 μ L反应体系包括:10×PCR缓冲液(含25mmol/L MgCl2)2.5 μ L,10mmol/L dNTPs 2 μ L,上下游引物(10mmol/L)各0.6 μ L,ExTaq 酶(5U)0.15 μ L,模板 2 μ L,用去离子水调整终体积至25 μ L。反应结束后各取5 μ L于1%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统下拍照。

2 结 果

5株 SS2福建分离株,4株基因型为gdh+/cps2J+/mrp+/ef-/sly-/fbps+/orf2+,1株基因型为gdh+/cps2J+/mrp+/ef+/sly+/fbps+/orf2+,实验室从病猪分离的SS2PFJ07基因型为gdh+/cps2J+/mrp+/ef-/sly-/f bps+/orf2+(见表 2)。所有菌株的电泳图见图1至7。

以下各图中:M.MarkerDL2000;1.PFJ080820;2.PFJ080842;3.PFJ080913;4.PFJ080942;5.PFJ080943;6.PFJ07;7.XT060821;8.空白对照.

3 讨 论

猪链球菌2型并不都具有致病性,根据菌株致病力的差异,将其分为强致病力菌株、弱致病力菌株以及无致病力菌株。先前的研究发现猪链球菌2型致病力的差异与该菌株的毒力因子有着密切的联系。Smith等〔3〕研究发现通过插入突变得到的无荚膜的等位基因突变株在体外很容易被猪肺泡巨噬细胞摄入,更重要的是,通过鼻腔接种无菌仔猪的突变株对其完全无致病性,由此可见,荚膜多糖与细菌致病力有关。曾巧英等〔4〕研究证明MRP可单独作为猪链球菌2型的毒力因子。由于M RP和EF在强毒株中检出率很高,在非致病菌株中检出率很低,因而MRP和EF常被认为是猪链球菌2型高致病性的标志〔5〕。SLY 对Hep-2细胞、内皮细胞和Vero细胞均具有一定的毒性作用,且经纯化后溶血素免疫的小鼠和猪均能耐受强毒株的攻击,所以推测其可能是猪链球菌2型的一种重要的致病因子,也是一种保护性抗原〔6〕。然而,猪链球菌2型的溶血素基因分布具有很强的地域性,来自欧洲的大多数菌株能产生溶血素,而来自北美的菌株不产生溶血素,但仍然具有致病性〔1〕。据相关研究证实基于GDH蛋白的检测可区分猪链球菌2型的强毒株、弱毒株和无毒株,同时,GDH也与猪链球菌的种属有关〔7〕。De Greef A 等〔8〕用缺乏 FBPS 的突变株与野毒株同时共同感染无菌仔猪,结果表明FBPS在细菌定植某些靶器官的过程中起一定作用。毒力相关序列orf2在强弱毒株之间的序列存在差异,这种差异可能与菌株致病性有关〔9〕。

表2 猪链球菌2型的毒力因子检测Table 2 The detection of virulent factor in SS2

了解福建地区猪链球菌2型分离株的毒力因子分布情况,有助于进一步了解福建地区SS2分离株的毒力基因型,为猪链球菌2型的防控提供科学依据。因此本研究选取上述7种主要毒力因子,通过对福建地区猪链球菌2型分离株进行PCR检测,研究发现从鼻咽拭子中分离的猪链球菌2型菌株都缺乏EF和SLY这两个毒力因子,从扁桃体上分离的猪链球菌2型菌株有一株也缺乏以上两种毒力因子,另一株同时具有7种主要毒力因子。猪链球菌2型菌株的毒力因子表型分布是否与其存在部位有一定的关系,还有待进一步的研究。由于分离的菌株数量有限,因此福建地区生猪猪链球菌2型分离株的毒力基因型是否主要为gdh+/cps2J+/mrp+/ef-/sly-/fbps+/orf2+,还有待对更多生猪猪链球菌2型分离株进行检测。

赵冉等〔10〕研究结果表明25株国内致病性猪链球菌2型分离株,96%(24/25)具有上述7种毒力基因,仅一株缺失ef,提示我国目前SS2流行菌株的毒力基因型主要为同时具有上述7种毒力基因的基因型;李春玲等〔11〕研究结果也显示我国健康猪猪链球菌扁桃体分离株毒力基因分布较为复杂,而且猪链球菌2型的优势流行菌株的毒力基因型为同时具有多种毒力基因的基因型。吕立新等〔12〕从健康生猪扁桃体中分离到一株同时含有上述7种毒力基因的猪链球菌2型。从上述可知本试验从健康生猪扁桃体中分离的具有7种毒力基因的菌株的基因型为国内优势基因型。据报道在国内猪扁桃体分离株中也发现一些新的基因型cps2J+/mrp+/ef-/sly-、cps2J+/mrp+/ef+/sly-、cps2J+/mrp*/ef-/sly-和cps2J+/mrp-/ef-/sly-,而本研究从生猪体内分离的其余4株猪链球菌2型与从福建地区病猪分离到的猪链球菌2型的基因型为gdh+/cps2J+/mrp+/ef-/sly-/f bps+/orf2+,因此其为新的基因型。本试验结果表明福建地区生猪中猪链球菌2型至少有两种毒力基因型。福建地区是否存在其它基因型还有待对更多的分离株进行检测。

〔1〕路玲玲,李蓉,郑玉玲,等.2型猪链球菌毒力因子研究进展〔J〕.中国卫生检验杂志,2008,18(3):570-572.

〔2〕俞伏松,车勇良,郭长明,等.猪链球菌2型福建株的分离鉴定〔J〕.福建农林大学学报:自然科学版,2008,37(3):290-294.

〔3〕Smith H,Damman M,Van,Der,Velde J,et al.Identification and characterization of the cps locus ofStreptococcus suisserotype 2:the capsule protects against phagocytosis and is an important virulencefactor〔J〕.InfectImmun,1999,67(4):1750-1756.

〔4〕曾巧英,陆承平.猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白诱导上皮细胞融合和凋亡〔J〕.微生物学报,2003,43(3):407-411.

〔5〕Norton P,Rolph C,Ward P,et al.Epithelial invasion and cell lysis by virulent strains ofStreptococcus suisis enhanced by the presence of suily sin〔 J〕.FEMS Immunol M ed Microbiol,1999,26(1):25-35.

〔6〕Staats J,Plattner B,Stewart G,et al.Presence of the Streptococcus suis suily sin gene and ex pression of M RP and EF co rrelates with high virulence inStreptococcus suistype 2 isolates〔J〕.Vet Microbiol,1999,70(3-4):201-211.

〔7〕Okwumabua O,Persaud J,Reddy P.Cloning and characterization of the gene encoding the glutamate dehydrogenase ofStreptococcus suisserotype 2〔J〕.Clin Diagn Lab Immunol,2001,8(2):251-257.

〔8〕De,Greeff A,Buy s H,Verhaar R,et al.Contribution of fibronectin-binding protein to pathogenesis ofStreptococcus suisserotype 2〔J〕.Infect Immun,2002,70(3):1319-1325.

〔9〕李干武,姚火春,陆承平.在猪链球菌2型江苏分离株中发现新的orf2毒力相关基因〔J〕.农业生物技术学报,2003,11(3):295-298.

〔10〕赵冉,孙建和,陆承平.猪链球菌国内分离株毒力因子的分布特征〔J〕.上海交通大学学报(农业科学版),2006,24(6):495-498.

〔11〕李春玲,余炜烈,贾爱卿,等.猪链球菌扁桃体分离株的毒力因子分布特征与致病性〔J〕.中国预防兽医学报,2009,31(2):104-109.

〔12〕吕立新,何孔旺,倪艳秀,等.从正常屠宰猪扁桃体中分离到致病性猪链球菌2型〔J〕.中国人兽共患病学报,2008,24(4):379-383.

Genetic analysis on the main virulence genes in the Fujian strain ofStreptococcus suistype 2 from slaughtered pigs

FANG Qin-mei,HUANG Shao-qian,YU Fu-song,ZHU Ji-chang,LIN Tian-long

(Instituteof Biotechnology,Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou350003,China)

To investigate the distribution of virulence associated factors of 5 strains ofStreptococcus suistype 2 from slaughtered pigs isolated in Fujian province,7 virulence genes were detected through PCR amplification.They were the glutamate dehydrogenase gene(gdh),the capsular polysaccharides gene(cps),the extracellular factor gene(ef),the muramidate-released protein gene(mrp),the suilysin gene(sly),the fibronectin-binding protein gene(fbps)and the virulence-associated sequence or f2.Among these 5 strains isolated,the virulence genotypes of 4 strainsS.suistype 2 and strain SS2PFJ07 was gdh+/cps2J+/mrp+/ef-/sly-/fbps+/orf2+and the other one strain isolated from slaughtered pigs was gdh+/cps2J+/mrp+/ef+/sly+/fbps+/orf2+respectively.This results showed that there are at least 2 virulence genotypes in Streptococcus suis type 2 from slaughtered pigs isolated in Fujian province.

Streptococcussuistype 2;Fujian strain;virulence-associated gene

文献标识码:A

1002-2694(2010)01-0065-04

*福建省科技厅项目(2006F3024、2006NZ0003-2、2006N0021)

林天龙,Email:lint05@163.com

福建省农业科学院生物技术研究所,福州 350003

2009-08-07;

2009-10-20