高效液相色谱-荧光法检测禽肉中七种氟喹诺酮类药物残留的研究

2010-08-16王维霞许永国王秀颖周大庆山东省诸城绿安检测有限公司262200

山东畜牧兽医 2010年10期

王维霞许永国王秀颖周大庆（山东省诸城绿安检测有限公司 262200）

氟喹诺酮类药物(Fluoroquinnolones，FQs)是近年来发展迅速并被广泛应用的新一代全合成抗生素。它抗菌谱广、高效、低毒、组织穿透力强，抗菌作用是磺胺类药的近千倍，与第3代头孢类抗生素相媲美。由于FQs是化学合成药物，价格低廉，故在医学和兽医学中应用广泛。在畜禽和水产养殖中，FQs主要用于治疗、预防和促生长。因其在体内代谢缓慢易残留，且致病菌产生耐药性和某些FQs的潜在致癌问题，其残留问题越来越引起人们的广泛关注。2006年日本肯定列表中严格规定了氟喹诺酮类药物检出限量，其中对沙拉沙星限量要求最高达0.01ug/kg，其次诺氟沙星也高达0.02µg/kg 。

目前，用于FQs残留检测的方法有微生物法、气相色谱法、气相色谱-质谱法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱法、免疫分析法等。但在现行国内标准和报道文献中常用的高效液相色谱法只能检测2、3种药物残留，本研究采用液液萃取进行样品前处理，用带荧光检测器的液相色谱仪梯度洗脱检测，可同时测定氧氟沙星(OFLX)、诺氟沙星(NOR)、恩诺沙星(ENR)、环丙沙星(CIF)、达氟沙星(DAN)、双氟沙星(DIF)、沙拉沙星(SRA)。本方法灵敏度高、准确、简单、快速，还有重现性好、检测成本低的特点。

1 材料与方法

1.1 仪器

美国WATERS公司高效液相色谱仪，配有2475荧光检测器，1525二元泵，WATERS SymmetryShieldTMRP18色谱柱；美国Milli-Q纯水仪；日本柴田 HW2B-20/20旋转蒸发器；上海安亭离心机LD5-2A；北京医用高速离心机LG16-W。

1.2 试剂和材料

乙腈、甲醇、正已烷均为色谱纯；氢氧化钠、磷酸、三乙胺、正丙醇为分析纯；纯水。氟喹诺酮类标准物质：氧氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、达氟沙星、双氟沙星、沙拉沙星标准品，纯度≥98%，日本关东株式会社生产。

1.3 色谱条件

色谱柱：WATERS SymmetryShieldTMRP18 4.6mm×250mm，5um；保护柱：柱温：38℃；流动相A：0.05mol/L磷酸三乙胺缓冲液(pH3.0)-乙腈(88+12)B：0.05mol/L磷酸三乙胺缓冲液(pH3.0)-甲醇(70+30)；波长：激发波长280nm，发射波长450nm；进样量：20µl；流速0.8ml/min梯度表为：

时间(min) 0 3 9 17 19 24流动相A(%) 100 100 0 0 100 100流动相B(%) 0 0 100 100 0 0

1.4 样品的制备

称取3.0g绞碎的样品于100ml离心管中，加入20ml氢氧化钠溶液(pH=12)－乙腈(1+19)提取液，15000r/min均质1min，3000r/min离心5min，将上清液倒入已加入25ml乙腈饱和正己烷溶液的100ml分液漏斗中，振摇5min，静置分层；收集下层于100ml鸡心瓶中，用20ml提取液洗刀头，把洗刀头液加入残渣中，涡旋混匀1min，超声5min，3000r/min离心5min，将上清液合并于分液漏斗中，振摇5min，静置分层；收集下层合并于鸡心瓶中，加10ml正丙醇，40℃水浴旋转蒸发至干；加入1.0ml流动相A溶解残渣，超声5min；移入1.5ml离心管中；加入0.5ml乙腈饱和正己烷溶液，12000r/min离心5min，若下层混浊除去正己烷层后重复加入乙腈饱和正己烷离心，直至变清为止，用2ml 1次性注射器吸取下层溶液，用0.45µm滤膜过滤，供HPLC分析。

1.5 测定

1.5.1 标准工作曲线的制备准确称取7种标准品各10.0mg，分别加于7只100ml棕色容量瓶，用0.03mol/L氢氧化钠溶液溶解定容至刻度，即成100µg/ml标准储备液。于2～8℃中保存3个月。吸取达氟沙星0.2ml外其余标准储备液各1.0ml于100ml的棕色容量瓶中，用流动相A定容至刻度，即成1.0(dan0.2)µg/ml标准混合中间工作液. 分别吸取标准混合中间工作液2、5、10、50、100、200µl，用流动相A定容至刻度，稀释成浓度分别为0.002、0.005、0.01、0.05、0.1、0.2µg/ml，达氟沙星浓度为0.0004、0.001、0.002、0.01、0.02、0.04µg/ml的标准工作曲线。

1.5.2 样品空白和空白添加回收试验每个批次试验中，均做1个空白样品和1个空白样品添加回收。空白样品添加量应等于最大残留限量，或方法定量限远优于最大残留限量时，应选在等于方法定量限上。本方法添加回收选在要求最严的最大残留限量0.01µg/g试验回收不仅用于对阳性残留结果的校正还可考量每批次检测的可靠性。

1.5.3 结果计算阳性样品结果计算根据样品与标准色谱图比较，选用峰响标准样品浓度单点校正，按：C=计算。C－样品中对应的每一种沙星的残留量(µg/g)；V－最终定量体积数(ml)；A－样品溶液中对应的每一种沙星色谱峰面积；A0－空白样品溶液中对应的每一种沙星色谱峰面积；AS－标准工作液中对应的每一种沙星的峰面积；CS－标准工作溶液中对应的每一种沙星的浓度(µg/ml)；m－样品重量(g)；R—样品回收率。

1.5.4 方法的灵敏度、准确度和精密度灵敏度：本方法的禽肉组织中达氟沙星的定量检出限为0.001µg/g，氧氟沙星、沙拉沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、双氟沙星定量检出限均为0.005µg/g。准确度和精密度：本方法在0.01µg/g添加水平下样品的回收率范围82%～94%，RSD＜10%。

2 结果与讨论

2.1 色谱柱的选择

在FQs的HPLC分析中标准和文献中大多采用反相色谱柱，如C18、C8等，因此选用相对成熟的C18柱，WATERS SymmetryShieldTMRP18色谱柱硅胶表面具有良好的低活性，分离度好，峰型尖锐。

2.2 流动相的选择

根据标准和文献报道比较，采用磷酸缓冲溶液作流动相可以得到良好的峰型，经使用农业部236号公告的磷酸缓冲溶液分析效果较好，但保护柱和色谱柱的使用寿命较短，参考色谱耐酸碱度和文献报道，把pH2.4调为pH3.0，经长期验证，分析效果基本相同，保护柱和色谱柱使用寿命延长1倍多。由于双氟沙星和沙拉沙星主要基团相似而分离不开，出峰时间在30min，分析时间长，故加入只对双氟沙星和沙拉沙星溶解度差别大的甲醇来调节。经试验用0.05mol/L磷酸三乙胺缓冲液(pH3.0)-乙腈-甲醇(83+10+7)完全分离最好，出峰时间在28min，分析时间长，不理想。为减少分析时间，采用梯度洗脱，经大量实验验证选用0.05mol/L磷酸三乙胺缓冲液(pH3.0)-甲醇(70+30)梯度洗脱在20min内可完全分离，全部运行时间为24min。见图1。

图1 7种氟喹诺酮混合标准品的色谱图

2.3 样品前处理条件的优化

FQs的前处理方法国内外报道很多.采用酸性或碱性有机相提取都有较好的回收率，但采用液液萃取蒸发浓缩，时间较长又不易蒸发至干。参考NY/TDJ320-2001检验技术规程和《兽药残留分析》，对较难蒸发的磷酸盐碱性乙腈提取液调为氢氧化钠溶液碱性乙腈，为保证碱度和禽肉组织足够用量，经大量实验验证，氢氧化钠溶液(pH=12)－乙腈(1+19)提取液满足要求。7种氟喹诺酮的回收率均在70%以上，提取效果好。