牛奶体细胞及牛乳中酶活性与隐性乳腺炎致病菌之间的相关性

蓝 响 屈常林 王怀娜

（①山东省烟台市烟台开发区古现兽医卫生监督检验站 264006 ②山东益生畜禽疾病研究院）

牛奶体细胞及牛乳中酶活性与隐性乳腺炎致病菌之间的相关性

蓝 响①屈常林②王怀娜②

（①山东省烟台市烟台开发区古现兽医卫生监督检验站 264006 ②山东益生畜禽疾病研究院）

奶牛隐性乳房炎，无明显临床症状，隐蔽性强，发生率高，主要影响奶牛产奶量及牛奶的质量，危害较大。据国内外报道可使牛奶产量下降10%～15%[1]。由于在临床上无肉眼可见的变化，很难对它作出临床诊断。除降低奶牛产奶量外，隐性乳房炎还可改变乳汁中的成分，降低乳汁中的乳糖、乳脂含量，从而影响牛乳的质量，且改变程度与隐性乳房炎的严重程度呈正相关[2,3]。奶牛患隐性乳腺炎时，表现为牛乳中体细胞数明显升高，牛乳中酶的活性也不断升高。因此，检测牛乳中的体细胞数以及牛乳中相关酶的活性，成为诊断奶牛隐性乳腺炎具有重要的参考指标[4,5]。分析牛奶体细胞数以及牛乳中酶的活性与奶牛乳腺炎主要致病菌之间的关系，对于了解奶牛隐性乳腺炎的致病机理，预防与治疗奶牛该疾病提供理论依据。

1 牛奶体细胞

1.1 牛奶体细胞与奶牛乳腺炎主要致病菌的相关性 细菌的感染对于乳腺组织来说是一种异物，它动员机体中的白细胞加以吞噬和拮抗，最终导致乳汁中体细胞数的增加，不论何种细菌的感染均可引起体细胞数的增加[5]。健康奶牛乳汁中的体细胞主要包括巨噬细胞(66%～88%)，嗜中性粒细胞、上皮多核细胞[6]。健康乳区中嗜中性粒细胞仅占1%～11%，但是在炎性感染期间，比例会上升至90%以上[6]，中性粒细胞在体细胞中所占的比例已经成为奶牛乳腺炎的一个炎性标志[7]。体细胞数是反映乳腺健康状况的重要标志，可根据体细胞计数的高低确定乳腺炎的发病情况，并且可进一步估算出牛奶损失。

据马保臣报道[8]：除棒状杆菌外，细菌感染后，SCC都有明显的升高，与对照组差异极显著(P＜0.01)，链球菌感染后SCC最高，其次是凝固酶阴性葡萄球菌，金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，假单胞菌，和酵母菌，这与Anakaco Shitandi and Gathoni Kihumbu (2004)[9]报道结果基本一致。测得链球菌，凝固酶阴性葡萄球菌，金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，假单胞菌，和酵母菌感染时SCC差异不显著(P＞0.05)，说明细菌的种类对SCC没有显著影响。

Djabri B.等[10]采用梅塔分析法研究了不同种类的细菌对乳区体细胞的影响：细菌学阴性的乳区，其平均体细胞数为68000个/ml，被少数致病菌感染的乳区其体细胞数在110 000～150 000个/ml，被多数致病菌感染的乳区其体细胞数高于350 000个/ml。被肠杆菌和链球菌感染的乳区其体细胞数平均值最高(＞1000 000个/ml)，被棒状杆菌感染的乳区其体细胞平均数最低，为105 000个/ml。

1.2 牛奶体细胞与牛乳中主要酶的相关性 目前国际上普遍以乳汁体细胞数作为判定奶牛隐性乳房炎的标准。因此，依据乳汁中体细胞数的含量分析各种酶类与隐性乳房炎的相关性。黄利权对奶牛隐性乳房炎乳汁中体细胞、乳酸脱氢酶(LDH)、碱性磷酸酶(ALP)、酸性磷酸酶(ACP)、谷氨酸草酰乙酸转氨酶(GOT)、谷氨酸丙酮酸转氨酶(GPT)和血清白蛋白(SA)及病原微生物的相关性进行了研究。结果发现LDH、ACP、GOT、GPT的活性和SA的古量变化与白细胞数之间存在授显著的相关关系(P＜0.01)，尤以LDH的相关性最强(r=0.858)；ALP与体细胞数之间无相关关系(P＞0.05)。这与Hambitzer[11]等人报道一致，乳汁中酶的含量增加主要有三种可能，Kitchen指出[12]，隐性乳房炎乳汁中的LDH和GOT主要来自于被损害的上皮细胞和大量的乳汁白细胞；血清白蛋白主要由于乳腺炎症引起泌乳组织的损伤，血一乳渗透性增加所致[13]；ACP则来自于胞浆(47%)、线粒体(37%)、核质(11%) 和微粒体(5%)，在乳腺炎症过程中，由于半胱氨酸和二硫苏糖醇刺激释放进入乳汁中[14]。因此，乳汁中上述酶类活性的增加充分反映了白细胞大量聚集的炎症过程和乳腺组织的损害程度。Pakhomov报道[15]，患隐性乳房炎的奶牛其碱性磷酸酶的活性有明显的变化，而从本研究中观察到，ALP的活性与乳汁体细胞之间并不存在相关性(P＞0.05)，这有待于进一步验证。各种酶类之间的相关性分析进一步发现，LDH 除了与ALP之间无相关性之外，与其余4种存在极显著相关性。由此认为，LDH在隐性乳房炎病理过程中起着重要的作用，可以作为诊断奶牛隐性乳房炎及乳腺损害程度的一个重要指标。

不同体细胞数等级的归类分析同样呈现这一趋势：随着体细胞数含量的增加，所测定的各种生化指标随之上升。在每ml乳汁体细胞数100×104至200×104的乳汁中，ALP和GPT的活性低于体细胞数50×104至100×104的乳汁，牛奶中血纤维蛋白溶酶的活性与牛奶体细胞计数呈正相关。体细胞数从100 000个/ml升高至1300 000个/ml时，血纤维蛋白溶酶的活性也升高2.3倍[16]。

S.Pyorala and E.Pyorala(1997)[17]研究发现，NAGase与体细胞数呈正相关，并且NAGase与不同的细菌感染也有相关性，葡萄球菌感染时，NAGase与体细胞数的相关性很强(r=0.941)，凝固酶阴性葡萄球菌感染时，NAGase与体细胞数的相关性较强(r=0.761)，在链球菌和大肠杆菌感染时，两者的相关性分别为r=0.808和r=0.733。

2 牛乳中的酶

2.1 牛乳中的NAGase酶与奶牛乳腺炎主要致病菌之间的关系 奶牛乳区在炎性感染期间，牛奶中的许多酶的含量都会增加。一些处理牛奶合成的酶会减少，而与炎症反应有关的酶会增加。来自吞噬细胞的酶会潜在的增加，包括NAGase酶，β-葡(萄)糖苷酸酶，过氧化氢酶。血液中酶的活性也会提高，例如血纤维蛋白溶酶原，本激活血纤维蛋白溶酶，也是一种降解血纤维和酪蛋白的分解蛋白酶。

β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAGase)是一种溶菌酶，产生于乳腺的组织，是乳腺上皮细胞破坏的标志(Kitchen et al 1978)[18]，另外，分叶核白细胞也是NAGase的重要来源，在乳腺炎时，10%～15%的NAGase来自分叶核白细胞，Emanuelson et al(1987)[19]认为，NAGase的活性可以预测乳腺的感染，Itchikawa等(1993)[20]认为，检测NAGase的活性是确诊乳腺炎的最可靠的方法。

NAGase酶是一种细胞内的溶菌酶，在吞噬细菌和细菌减少的过程中被释放到牛乳中，在一定程度上会损害上皮细胞[21]。牛奶中NAGase酶活性的主要部分在细胞间，经过反复冻融后样品中其活性释放最多[22]。在几个研究中发现，NAGase酶的活性能够可靠检测出由乳腺炎致病菌引起的炎症感染[23,24]。牛奶中NAGase酶的活性与牛奶体细胞计数密切相关[25,26]。它可以准确地反映炎性感染程度，因此，在由多数致病菌引起的乳腺炎中，牛奶中NAGase酶的活性明显的高于由少数致病菌引起的乳腺炎中NAGase酶的水平。当牛奶体细胞数高于400 000个 /ml时，检测牛奶中NAGase酶活性水平可以作为检测亚临床性乳腺炎的一个阳性参考指数。由于平均只有17%假阳性和2%的假阴性诊断率，总体结果表现良好。NAGase酶的活性在泌乳早期升高，然后逐渐增加至泌乳期末端[24,25]。然而在健康的乳区，在产后第5天已经达到正常水平。

2.2 牛乳中的其它酶与奶牛乳腺炎主要致病菌之间的关系 不同的病原菌对隐性乳房炎的致病作用不一样，金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和乳房链球菌为乳房炎的主要致病菌，而表皮葡萄球菌和G-杆菌为条件性致病菌[27]，不同的乳房炎病原微生物感染乳腺呈现不同的酶象变化，与阴性感染的乳腺相比，各酶的活性均出现增加，尤以金黄色葡萄球菌感染的乳腺有关酶的增加幅度最为显著(P＜0.01)。黄利权报道[28]奶牛乳腺炎主要致病菌感染的乳区含量除了ALP之外，其余普遍高于阴性乳区，同样也高于条件性致病菌感染的乳区，尤以金黄色葡萄球菌最为明显，其中6项指标中有4项显著高于阴性乳区(P＜0.01)。Ishikawa等人[13]分析被金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、乳房链球菌和化脓棒状杆菌感染后的乳汁血清白蛋白，发现金黄色葡萄球菌感染乳中血清白蛋白的含量最高，明显高于阴性感染乳区。可见金黄色葡萄球菌在乳房炎致病菌中的重要位置。

3 结论

奶牛乳腺炎主要致病菌对奶牛体细胞数具有一定的影响，由多数致病菌引起的奶牛乳腺炎，其体平均细胞数要高于由少数致病菌引起的奶牛隐性乳腺炎。乳酸脱氢酶(LDH)，酸性磷酸酶(ACP)，答氨酸草酰乙酸转氨酶(GOT)，各氨酸丙酮酸转氨酶(GPT)的活性和血清白蛋白(SA)的古量变化与白细胞数之间存在极显著的相关关系(P＜0.01)，尤以LDH的相关性最强(r=0.858)；碱性磷酸酶(ALP)与体细胞数之间无相关关系 (P＞0.05)；牛奶中血纤维蛋白溶酶的活性与牛奶体细胞计数呈正相关。

在由多数致病菌引起的乳腺炎中，牛奶中NAGase酶的活性明显的高于由少数致病菌引起的乳腺炎中NAGase酶的水平。不同的乳房炎病原微生物感染乳腺呈现不同的酶象变化，与阴性感染的乳腺相比，各酶的活性均出现增加，尤以金黄色葡萄球菌感染的乳腺有关酶的增加幅度最为显著(P＜0.01)。不同的乳房炎病原微生物感染乳腺呈现不同的酶象变化，与阴性感染的乳腺相比，各酶的活性均出现增加，尤以金黄色葡萄球菌感染的乳腺有关酶的增加幅度最为显著(P＜0.01)。

不同的乳房炎病原微生物感染乳腺呈现不同的酶象变化，与阴性感染的乳腺相比，各酶的活性均出现增加，尤以金黄色葡萄球菌感染的乳腺有关酶的增加幅度最为显著(P＜ 0.01)。评估奶牛经过抗生素治疗乳腺炎后是否治愈，与体细胞计数监测奶牛的恢复情况相比，NAGase酶活力更适合补充细菌学检查[29]。

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