副鸡嗜血杆菌液体发酵培养试验研究

付 强 沈志强 刘吉山 李 峰 （山东省滨州畜牧兽医研究院 256600 ）

鸡传染性鼻炎(infectious coryza，IC)是由副鸡嗜血杆菌(haemophilus paragallinarum，Hpg)引起的一种鸡急性上呼吸道传染病。目前本病在世界许多地方都有发生和流行。本病发生后可引起蛋鸡产蛋量下降，育成鸡生长发育受阻和淘汰率增加，肉鸡肉质下降，给养鸡业造成重大的经济损失[1]。

免疫接种是预防本病的主要措施之一。目前主要使用灭活菌苗，国内预防IC以A型、C型单双价灭活苗为主，Matsumoto M等[2-3]研究发现，经卵黄囊接种培养制备的疫苗保护率低于经肉汤培养制备的疫苗，而且卵黄中杂蛋白含量较多，粘稠且难于确定疫苗中的总菌数。肉汤摇瓶培养(生物制品规程2000版)产量低，成本高，液体发酵培养技术能很好的解决此类问题，但国内对副鸡嗜血杆菌液体发酵培养工艺的报道不多，为此我们进行了多次A、C型IC的发酵培养试验，摸索培养条件，取得良好效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 副鸡嗜血杆菌Hpg-8，由中国兽医药品监察所鉴定、保存和供应，冻干保存。

1.1.2 主要仪器 GUJS-10L型发酵罐，镇江东方生物工程设备技术公司生产。水浴摇床。7200型紫外分光光度计。

1.1.3 培养基 IC琼脂平板：副嗜血杆菌培养基干粉，青岛高科园海博生物技术有限公司，按说明配制，加入1.5%(W/V)琼脂粉，115℃高压灭菌20min，降温至50℃左右时，加入10%的鸡血清和0.05%的辅酶Ⅰ，混匀，倾倒灭菌平皿，4℃保存备用。摇瓶培养基BHC：半合成培养基，按生物制品规程2000版配制。发酵培养基：半合成培养基，按生物制品规程2000版配制。

1.1.4 其它 鸡血清，郑州益康生物工程有限公司。辅酶I，产地Roche。

1.2 方法

1.2.1 一级种子制备 将菌株HPg-8接种于5日龄SPF鸡胚卵黄囊内，置37℃继续孵育，取30h内死亡的鸡胚卵黄囊，-20℃冷藏保存，应不超过1个月。

1.2.2 二级种子制备 取感染的鸡胚卵黄液，划线接种IC平板，置于含5%～10% CO2培养箱内，37℃培养16～18h。挑荧光性强的典型菌落接种于IC平板，置于含5%～10% CO2培养箱内，37℃培养16～18h，不超过6代。将菌苔用灭菌BHC洗下，分别接种于400ml BHC中，并加入2%鸡血清，置37℃恒温100rpm震荡培养7～8h，纯检合格后，做为二级种子，置2～8℃保存。

1.2.3 发酵种子制备及最佳培养时间和保存期的确定将二级种子按2%接入400mlBHC中，并加入2%鸡血清，置37℃恒温100rpm震荡培养16h，每1h取5.0ml，进行OD值检测，以OD值为纵坐标，培养时间为横坐标，作生长曲线(图1)。发酵菌种在摇床培养8h及冷藏后24h、48h各做活菌计数，观察活菌数变化。

1.2.4 发酵培养工艺要求 将2.3项培养的种子液4%及发酵液体积4%鸡血清、辅酶I0.003%和0.2%葡萄糖，接种于已灭菌的发酵罐培养基中，37℃培养，pH7.2～7.4，搅拌转速150rpm，通气比为1:4，接种后每隔2h取样做吸光度检测和活菌计数。

1.2.5 收获及浓缩 按生物制品规程2000版，浓缩至50亿/ml，灭活冷藏保存备用。

2 结果

2.1 各培养批次发酵菌种OD值 （见表1）

表1 不同培养时间(h)各培养批次发酵菌种OD值

图1 发酵菌种OD600随培养时间的变化曲线

OD600生长曲线表明，摇瓶菌种的最佳培养时间控制在8～10h，有利于发酵时缩短静止期，超过12h，菌体形态出现长丝状，OD值降低，此时细菌衰亡老化，不适合发酵罐接种。

2.2 发酵菌种保存时活菌数变化曲线

从图2可以看出，发酵菌种活菌数随时间呈大幅下滑的趋势，所以菌种培养完毕后应及时接罐。

2.3 各批次发酵培养时OD600值及活菌数 （见表2）

表2 不同培养时间(h)各批次发酵培养时OD600值及活菌数 (亿/ml)

菌种接入约4h后细菌进入对数增殖期，发酵10～14h后OD值有下降趋势。发酵时产酸，通过流加碱液控制pH值7.4左右。

本试验条件下培养10h活菌数的平均值为16.5/ml，菌体形态均一；培养12 h后活菌菌数有下降趋势，平均值为13.4亿/ml，镜检有长丝状菌出现，着色浅，有老化迹象，故发酵培养收获时间为10～12h即可。

3 讨论

培养副鸡嗜血杆菌的液体培养基有多种，常见的有：市售副鸡嗜血杆菌干粉、半合成培养基和鸡血清鸡肉汤，胰酪胨大豆肉汤TSA均能支持副鸡嗜血杆菌的生长，但从疫苗的生产成本考虑，半合成培养基为最佳选择。

本研究的试验结果表明，副鸡嗜血杆菌hpg-8株(血清A型)摇瓶菌种在水浴摇床中振荡培养8～10h生长达最高峰，静置培养时生长较差，与张洪等[4]试验结果基本相同。液体发酵培养10～12h生长达最高峰，活菌数为13～16×108/ml，发酵培养时间不易超过12h。

发酵培养活菌数明显高于鸡胚培养方法，适合工业化大规模生产，但仍需通过浓缩工序进一步提高菌数，以满足规程要求，发酵工艺有待于进一步提高。

[1]吴清民. 兽医传染病学[M]. 中国农业大学出版社. 2002.

[2]Matsumoto M.Pretective quality of an alum inumhydroxide absorbed broth bacteria against infectious coryza[J].American J Vet Ras, 1975, 6:579-582.

[3]Davis PB,RB Rimler,EB Shotts,et al.Efficacy studies on Haemophilus gallinarum bacterin preparations [M].American Journal of Veterinary Research, 1976, 37:219-222.

[4]张洪,王文泉等. 副鸡嗜血杆菌在疫苗生产中生长特性的研究[J].中国兽药杂志. 2003, 37(5):15-17, 20.