插入序列在水稻白叶枯病菌防治上的研究进展

佘宇佳，高必达

（湖南农业大学生物安全科技学院，湖南 长沙 410128）

1 水稻白叶枯病的危害

水稻白叶枯病（Xanthomonas，oryzae pv.oryzae，简称Xoo）最早发现于1884年日本福岗地区，现已是一种世界性的重要细菌病害[1-2]。从20世纪中叶以来，发病范围逐步扩大，在亚洲、非洲、欧洲、美洲均有发生，且以亚洲发生最为严重。而我国主要发生在华东、华中、华南稻区，在其他部分稻区也有零星分布[3]。水稻白叶枯病菌是由革兰氏阴性菌黄单孢水稻变种引起的一种维管束病害[4]。病原菌经伤口或水孔等进入寄主维管束，在木质部中大量繁殖，然后通过维管束蔓延至整个植株，最后导致病害不断扩大加重[5]。白叶枯病在潮湿和低洼地区发病比较频繁，一般籼稻重于粳稻，双季晚稻重于双季早稻，单季中稻重于单季晚稻，矮秆阔叶品种重于高秆窄叶品种，不耐肥品种重于耐肥品种。水稻在幼穗分化期和孕期易感病。受灾后的水稻叶片枯萎，光合作用受到妨碍，稻穗的充实率降低，致使不实粒增加，同时造成米质疏松脆裂，食味降低。一般减产20%～30%，严重时能够达到50%，甚至不能抽穗导致绝收[5]。

2 插入序列

1989年世界上首次报道插入序列（Insertion sequence，简称IS），至今在原核生物和真核生物中发现了超过500种不同的IS。最简单的转座子不含有任何宿主基因、在基因组中存在一个或多个插入位点的小分子DNA片段常被称为插入序列，广泛存在于原核和真核生物界中，同时细菌染色体和质粒的重要组成部分[6]。IS在细菌基因组能编码、自主进行转座、插入位点随机、插入后使宿主染色体的插入位置上产生短的正向重复序列等。这些都能造成宿主基因缺失或诱发突变，以致同源宿主差异的产生。所以IS对那些具有使植物染病能力的细菌在不同环境的生存起着重要作用，且常被作为一种标记物用来鉴定细菌的种群结构特征[7]。

IS的两大特征是：（1）插入序列在插入靶位点，造成左右两端的重复；（2）插入序列在插入靶位点上自身终端序列都会生成较短的反向重复序列（Inverted repeat，IR）。大多数 IR 为 10～40 bp 左右，分为两个功能区域，一个是发生转移反应的断开之处，长度只有2～3 bp，另一个对特异性序列进行识别，与T转座酶相连接。IS的转座的概率是极小的、插入位点随机，与自发突变率同一个数量级，其精确切离可诱发的突变回复为野生型，不精确切离可能会导致两端相连的基因沉默或缺失。

3 IS在防治水稻白叶枯病中的重要性

水稻白叶枯病是危害我国水稻生产的主要病害之一，传统的化学防治难以对水稻白叶枯菌奏效，种植抗病品种是现在国内外普遍使用的防治方法。水稻抗病性的遗传研究始于日本，至今已有近30种水稻白叶枯抗性基因从不同的水稻品种和野生稻中鉴定出来，其中许多被用于水稻育种和疾病控制[8]。我国主要栽培品种所带有的抗白叶枯病基因源主要为Xa3（粳稻）和Xa4（籼稻）。但长时间、大规模种植单一抗源的品种必将引起病原菌群体遗传结构的变化，产生新小种，导致品种抗性的丧失。如印度尼西亚，印度，菲律宾和我国稻区大量种植带有单一Xa4抗源的品种，已造成白叶枯病源菌小种的发生改变，导致这个抗性基因在我国部分稻区已基本丧失抗性。

从进化上看，基因的内部IS水平转移和重复序列的增加或缺失是植物病原细菌致病性变异的主要途径。利用位点克隆和转座子标定技术已分离出多种新的植物抗病基因，其中包括水稻抗白叶枯病的Xa21和Xa1基因。弄清基因、IS与毒力的相互关系是快速鉴定、区分Xoo致病型的前提，同时也是当前防治水稻白叶枯病的重要策略。Ardales等[9]在对日本白叶枯病菌株MAFF311018进行研究时，发现基因组中包含大量的插入序列和无毒基因，病菌的致病型和通过由插入序列获得的病菌进化分类存在着对应关系。Ochiai、Ardales等分别以IS1112、IS1113为探针对斯里兰卡和菲律宾水稻白叶枯病菌的研究，证实了插入序列与病菌的致病型之间存在一定的相关性。由此可见插入序列在基因组进化中具有重要作用，与水稻白叶枯病菌的致病型的分化，毒力强弱等有相关联系，这对研究插入序列提供了良好的基础。因此，全面分析IS、比较各菌株之间IS的分布差异及其整合特性对研究不同国度及区域的白叶枯病菌的毒力分化，以及抗病品种的合理布局、轮换和相互间的交流，都具有十分重要的意义。

4 水稻白叶枯病菌各致病型的鉴定方法

水稻白叶枯病是一种利用寄主的抗性能够有效控制危害的细菌病害，与其寄主水稻是协同进化的关系。方中达[10]从全国各病区采集了835个菌株，将其分为了7个致病型。而王春莲等[11]发现我国同一区域白叶枯病原菌发生了变化，并推测病原菌的变化可能是大面积种植的水稻感染了其他类型的致病型，研究表明水稻白叶枯病原菌的群落结构随着抗性品种的种植而发生了改变。

对于水稻白叶枯病原菌致病型的鉴定可以通过生理特征、生化性质、毒性以及分子水平等不同角度来衡量，但各有不足。如生理生化手段是建立在菌株外在生物学特性的基础上的，在不同的条件下，不同的实验操作、分析下会导致不同的实验结果，因为在Xoo中与致病力相关的某些蛋白是可诱导表达的，Tsuge等[12]发现Xoo中的一些蛋白在特定的培养基上才能表达。

从分子角度来看，对Xoo全基因组测序无疑是最精准的方法。基因组是用于描述生物的全部基因和染色体组成，将Xoo的全基因组测序可以破译其全部遗传信息，这对研究Xoo自身遗传信息和结构、Xoo与相关寄主因子及其致病性，培育抗病新品种水稻有着极其重要的意义。基因的结构和功能分析，将使人们深入认识及Xoo的侵染及水稻抗病的机理，大规模的试验技术也将会使人们有更多机会筛选到更好的抗性基因，这也是控制水稻白叶枯病害的更加安全和经济有效的方法。目前已彻底完成全基因序列测定并公布的有3个水稻白叶枯病小种：日本菌株MAFF311018，韩国菌株KACC 10331和菲律宾菌株PXO99A。比较分析3种水稻白叶枯病基因组，发现MAFF和KACC的基因组总的来说在基因含量和组织结构上都高度地相似，而PXO99A与MAFF、KACC差异甚大。Ochiai等在测定MAFF全序列时也将IS做了分类统计：共有25种类型多达611个插入序列，其中386个为完整IS，225个为不完整IS，这些序列总和占到菌株全基因序列的10%（MAFF全序列为4 940 217 bp）。Xoo属于高适应性种类，在不同的环境下能分化出不同的致病型，所以想要测定所有致病型的全基因组序列几乎是不可能的。对基因组上特定位点序列的比较是一个相对容易且成本低廉的方法，通过对存在差异性的位点研究分析，可以探明它们的系统进化关系。

白叶枯病原菌的分类长期采用的是植物病理学的方法，将寄主上抗性反应型来划分致病型。但随着分子生物学的兴起，近20年，国内外研究白叶枯病原菌多样性的手段逐步变为以RFLP与PCR为主。对IS的拷贝数及插入位点的研究大多采用的是RFLP、Southern杂交rep-PCR、和IS-PCR技术。Rep-PCR和IS-PCR均利用IS多拷贝序列上的部分序列作引物来扩增IS及其旁侧序列，通过分析不同种群中的差异来研究种群之间的遗传多样性。这些PCR方法虽然能形成直观的指纹图谱但灵敏度不高，而PCR技术检测周期长、假阳性现象时有发生，这些对IS研究有一定的局限性。RFLP与Southern印迹杂交的方法是测定基因拷贝数、遗传图谱构建、分析细菌群落结构和多样性的标准方法。其特点是：数据多态信息量大，呈共显性标记，不受显隐性关系、环境条件、发展阶段及组织部位影响，结果稳定，重复性好，探针多。但这些都十分费时费力。特别遇到一个插入位点有多拷贝的TDNA片段插入时，用Southern杂交在酶切时会产生相似的DNA片段，电泳分析时很难分辨清楚。而绝大数的IS拷贝数众多且插入位点复杂，用RFLP、Southern杂交进行测定拷贝数难以得到真实准确的结果。易用性日益成为主要的核酸定量检测技术，随着科技的发展，功能更强大、更特异、更灵敏的荧光标记染料不断出现，实时荧光定量PCR技术将在水稻白叶枯菌的遗传多样性研究中得到广泛的运用。

5 展望

水稻与白叶枯病原菌互作符合基因对基因的关系[13]，这使得对水稻白叶枯病的研究已成为研究寄主和病原物互作的模式，当今对于水稻白叶枯菌的研究主要集中在白叶枯菌致病性基因和遗传多样性上。IS是一个能自行转座的小DNA片段，它的移动能造成邻近基因的改变，从而使生物体生物学性状产生变化。所以对水稻白叶枯菌的IS的研究有利于更好的区分水稻白叶枯菌各个不同的致病型及掌握它们的特征。其中水稻白叶枯菌中IS的拷贝数、靶标位点及其旁侧序列是区分不同致病型的重要方面。实时荧光定量PCR技术由于其灵敏性及

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