农杆菌介导水稻转基因技术的原理与应用研究进展

张红霞，邓启云，吴 俊

（1.中南大学隆平学院 湖南 长沙 410125;2.湖南杂交水稻研究中心 湖南 长沙 410125）

转基因技术就是利用DNA重组技术，将克隆到的外源优良DNA导入到植物体细胞基因组中，改变作物的遗传性状，使其朝着人们理想的方向发展。从1983年第一例转基因植物——烟草问世以来，转基因技术发展迅猛，至2005年转基因植物已经在21个国家进行种植。2009年，全球种植转基因作物达1.34亿hm2。转基因技术方法主要有基因枪法、电激法、PEG法、花粉管介导法和农杆菌介导法。农杆菌介导转化法具有转化的外源基因结构完整、整合位点较稳定、转基因低拷贝、基因沉默几率低、遗传稳定以及能够转化大片段的DNA（可达50 kb）等突出优点[1－2]，成为目前应用最多的转基因技术。近年来，国内外广泛开展了水稻转基因研究工作，已经有多个有益农艺性状基因导入到水稻材料中，并且获得了大量的转化植株。本文就水稻农杆菌介导转化的原理、研究进展及转化基本因素进行综述。

1 水稻农杆菌转基因原理

农杆菌转化系统是一种天然的基因转化系统。农杆菌分为根瘤农杆菌和发根农杆菌。根瘤农杆菌中含有肿瘤诱导（Ti）质粒，Ti质粒上含有可转移DNA(T-DNA)区、毒性区（Vir区）以及冠瘿碱代谢基因编码区。T-DNA两端是两个25 bp的重复序列，分别称为左边界和右边界，两个边界序列之间是生长素和细胞分裂素合成基因以及冠瘿碱合成基因。Vir区中也含有多个基因段，如VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG、VirH等，每个基因段都含有多个基因。当植物受到伤害时，分泌含有酚类化合物的汁液，这些酚类化合物一方面通过染色体毒性基因（chvA、chvB）等介导的趋化性促使农杆菌向植物受伤部位移动并附着于植物细胞表面；另一方面则被Ti质粒上由VirA和VirG组成的双组分调节系统识别，从而诱导其他Vir的表达。VirD1和VirD2共同作用，由T-DNA右边界开始向左边界切割产生一条T-DNA单链，并与Vir其它表达蛋白结合成复合体转移到农杆菌外，然后进入细胞到达细胞核内并整合到细胞染色体上。

T-DNA的转移只与两个边界序列有关，尤其右边界对T-DNA的准确转移是不可缺少的，而边界序列之间含有什么基因并不影响T-DNA的转移。因此，可以用外源基因代替T-DNA区内的基因，进而利用农杆菌将这个改造后的T-DNA转移到植物基因组中，这样就可以获得所希望得到的转基因植株。随着对农杆菌转化系统的了解不断深入，人们对Ti质粒进行了多种方式的改造，使载体系统不断更新，转化效率逐渐成熟，应用范围越来越广泛。

2 农杆菌介导水稻转基因技术的发展概况

农杆菌介导的水稻遗传转化研究最早始于1986年，Babat[3]等通过PEG法将农杆菌原生质球与水稻原生质体融合，获得了部分能够合成胭脂碱的水稻愈伤组织。1992年Chan[4]以成熟胚、离体根为起始材料进行研究，但未能获得转基因再生植株。l993～1994年，农杆菌介导的水稻遗传转化研究取得了重大突破，Chan等[5]首次通过农杆菌介导获得了转基因植株，随后，Hiei等[6]实现了对粳稻的高频转化，转化率达到28.6%，表明粳稻的农杆菌介导转化体系已基本建立起来，该研究同时也证明水稻盾片是良好的外植体来源，且农杆菌携带的双元载体能够明显提高粳稻比如越光稻的转化频率。此后的十几年，农杆菌介导水稻遗传转化研究得到了迅速发展。Rashid等[7]将农杆菌介导转化法应用于优质籼稻Basmati370水稻取得成功，且发现乙酰酊香酮在共培养阶段是必不可少的。Dong等[8]报道农杆菌转化在爪哇稻Gulfmont和Jefferson上取得成功；Hoque等[9]于2005年建立了适合于孟加拉籼稻种质的农杆菌介导转化体系，并证明水稻幼胚作为外植体较成熟胚有更高的转化率，共培养时间为3 d最优；Hiei和Komari[10]2006年建立了一套适合籼稻I群体的高效转化体系，证实转化效率与凝胶剂的种类和共培养基成分密切相关。林拥军等[11]建立了农杆菌介导的粳稻品种牡丹江8号的高效转基因体系。王逸群等[12]采用农杆菌介导法将高赖氨酸蛋白基因导入到谷秆两用水稻中，GUS组织化学染色、PCR扩增、Southern杂交等分析都表明，该基因已经整合到水稻基因组中；他们对9株转基因水稻叶片赖氨酸含量进行测量，发现大部分植株的赖氨酸含量都有明显的提高，最高幅度达到了22.71%。胡昌泉和苏军等[13]采用农杆菌介导法将胚乳特异性表达谷蛋白1（Glutelin1，Gtl）基因控制下的可溶性淀粉合成酶基因sss导入籼稻恢复系明恢86，共获得53个独立转化再生植株。PCR检测表明，sss基因已整合进水稻的基因组中。直链淀粉含量测定结果表明，转基因植株后代直链淀粉含量较对照有较大幅度的下降；胡利华，吴慧敏等[14]利用根癌农杆菌介导法将柠檬酸合成酶（citrate synthase）基因CS导入杂交籼稻优良恢复系明恢86，共获得48株T0再生植株，通过分子检测，证明有阳性植株产生。Ignacimuthu等[15]将来源于菜豆种子的α淀粉酶阻抑基因通过农杆菌介导法转入到Basmati水稻（PB1）中，174个潮霉素抗性植株产生并呈GUS阳性反应。PCR和Southern杂交证实4.9 kb长的α淀粉酶阻抑基因已经存在，并通过Western印记杂交证实相关蛋白的表达。总的来说，农杆菌介导水稻遗传转化在近十年里取得了显著进展，不仅为水稻品种的遗传改良奠定了基础，而且为水稻的分子生物学提供强有力的实验证据。

3 农杆菌介导水稻遗传转化的基本因素

3.1 水稻亲本和受体

Chan等[5]研究发现粳稻转化频率较籼稻转化频率高，这可能与籼稻愈伤组织形成、继代和再生植株困难等因素有关。在水稻的遗传转化中，通常转化受体来源于幼胚、幼穗和成熟胚的生长旺盛的胚性愈伤组织[16]，但是不同来源的愈伤组织的转化频率是不一样的。Vijayachandra[17]研究水稻不同组织（细胞）对农杆菌vir基因的诱导，结果表明，盾片和盾片来源的愈伤组织是最容易被农杆菌转化的组织。黄健秋等[18]采用未成熟胚来源的愈伤组织进行根癌农杆菌转化时，其转化频率均高于成熟胚来源的愈伤组织的转化频率，平均高出1～2倍。因此，幼胚与成熟胚作为外植体各有优势，显然选择幼胚作为愈伤组织来源更适合为转化的受体，转化效率较高，但是幼胚受到季节的限制且易被污染，成熟胚来源的愈伤组织虽然转化频率低，但是污染程度相对较低，且成熟胚可长期保存。郑杰[19]就是以水稻基因组测序品种日本晴成熟胚为研究材料,对根癌农杆菌介导的水稻转化系统进行了优化，最终GUS表达率达到30%。此外，转基因技术是一项针对性很强的单一性状遗传改良技术，受体亲本应选择综合农艺性状更好的品种。近年来，超级稻的转基因研究已受到关注，并可能成为水稻转基因的重要研究方向之一。

3.2 农杆菌菌株和质粒要求

3.2.1 农杆菌菌株 选取合适的农杆菌菌株和优良的质粒对转化来说非常重要。用于水稻转化的农杆菌菌株较为普遍的有 A281、A656、LBA4404、EHA101、EHA105、AGL1。李双成[20]等以 3 个籼稻品种和2个粳稻品种为对象，对农杆菌转化水稻过程中影响转化效率的因素进行了研究，其研究发现菌株AGL1和EHA105按一定比例混合共转化对抗性愈伤率有显著影响。现在应用最多的是EHA105菌株。

3.2.2 质 粒 对质粒的要求有选择标记，启动子，外源基因等。常用的选择标记有三类:潮霉素磷酸转移酶基因（hpt基因）、新霉素磷酸转移酶基因（npt基因）和除草剂抗性基因（bar基因）。而启动子的种类与靶细胞中基因的表达水平密切相关，水稻基因转化中所使用的启动子主要有CaMV35S启动子、Nos启动子、Actl启动子、Ubiquitin启动子等。以常用的表达载体pCAMBIA1301为例，该质粒总长为13.1 kb，其T-DNA左右边界内的区段含有hpt基因，gus基因和多克隆位点，其中的启动子为35S启动子。

3.3 转化不同阶段培养基与技术操作

3.3.1 诱导阶段 对水稻的愈伤诱导其基本培养基有 NB，CC，N6，MS。殷丽青等[21]研究发现 NB 培养基是粳稻品种广泛运用的诱导培养基，且NB培养基在籼稻愈伤诱导中也比其他培养基好一些。

3.3.2 共培养阶段 这一阶段的培养基非常关键，其中乙酰酊香酮则是必不可少的成分。另外，愈伤组织细胞处在DNA复制阶段以及浸泡愈伤组织时农杆菌有合适的浓度对转化效率都有着重要的影响。一般共培养时间是2～3 d。部分研究发现，若在共培养基上垫一层滤纸，然后将愈伤接种到滤纸上，可以减少农杆菌的污染。

3.3.3 筛选与分化 筛选和分化阶段的培养基，主要注重抗生素的浓度以及激素的配比。过高的抗生素浓度会杀死阳性愈伤，反之则不能起到很好的筛选作用。共培养后愈伤接种到筛选培养基的操作也显得非常关键。如进行漂洗，干燥处理等。周玲艳[22]发现愈伤组织经干燥处理不仅可以有效杀死农杆菌，而且可以改善愈伤组织状态，提高转化率。李双成[20]认为琼脂粉加倍和超净工作台上风干4 h的方法是最适合的干燥培养方式。切取筛选后的愈伤组织要经过预分化处理，其目的就是使愈伤组织胚性增强，分裂与再生能力提高，这样有利于外源基因整合[20]。然后将愈伤组织转入到分化培养基，进行光照和暗室的循环处理，使其大量分化。

3.3.4 壮苗生根 分化3周后，转入到生根培养基中进行壮苗生根培养，这一阶段要保证其有处在正常的生理环境中，如光照，湿度以及黑暗处理。再生植株成长到一定阶段，就可以检测其基因导入情况。

4 展望

水稻是世界上最大的粮食作物，全球超过三分之一的人口都以稻米为主食。长期以来，水稻杂交育种研究取得了令人瞩目的成绩，水稻产量大幅度提升。育种家们采用人工常规杂交技术选育了成千上万的品种并应用于生产，为保障粮食安全与经济社会稳定做出了巨大的贡献。传统技术一般可在生物种内个体上实现基因转移，但操作的精确性较差，选育时间较长。而转基因技术转移基因可不受亲缘关系的限制，且基因操作选择的准确性较高，此外基因的精确导入还能大大缩短育种年限。因此，转基因技术与常规育种技术的紧密结合可以大大提高育种效率。随着越来越多的有益基因被克隆和鉴定，农杆菌介导法必将在今后的分子育种中发挥越来越大的作用。

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