药物小分子与蛋白质相互作用研究进展

王 玲,张 崭,梁瑞玲

(1.郑州师范学院,河南郑州450044;2.河南城建学院,河南平顶山467036;3.河南省疾病预防控制中心,河南郑州450016)

近年来,有关蛋白质与小分子间相互作用的研究成为人们研究的热点,尤其关于药物小分子与蛋白质间相互作用的研究更是引起人们的广泛兴趣和共同关注。药物小分子与蛋白质间相互作用的研究不仅有助于从分子水平上了解蛋白质与小分子的作用机理与规律,而且有助于认识药物的转运和代谢过程,为新的高活性的药物小分子的设计与开发研究提供有价值的信息及理论指导。

1 小分子与蛋白质作用机理

小分子在血清白蛋白上至少有两类结合：强结合和弱结合。在大多数情况下,强结合小于10[1]。小分子与蛋白质相互结合的主要部位是蛋白质上的碱性氨基酸残基,这些碱性氨基酸残基包括精氨酸、赖氨酸、组氨酸和N端氨基,其间相互作用力有静电作用力、疏水作用力和范德华力等。在通常情况下,其相互作用是靠多种作用力相互协同,而不是某一作用力的单独作用的结果[2]。Kragh-Hansen[3]通过实验详细地研究了静电力在小分子酚红与血清白蛋白间所起的作用,并认为疏水作用力也是小分子与蛋白质相互作用的一种重要方式。Lakin[4]曾指出CBBG-250可以与蛋白质的疏水部位依靠疏水作用力相互作用。MosheTal[5]认为虽然蛋白质所带正电荷决定了所结合染料数目,但仅仅依靠静电力是不能紧密结合的。Compton[6]用聚氨基酸与CBBG-250反应时发现不带电荷的聚芳香族氨基酸与CBBG-250有反应。这都表明非静电力起了很大的作用。Jonas[7]专门研究了蛋白质疏水区域与疏水荧光探针ANS的相互作用。在疏水氨基酸残基中,色氨酸残基最引人注意。有作者认为疏水阴离子就是结合在色氨酸残基附近[8]。因此,结合作用力一般不是某一种作用力的单独作用,而可能是静电引力、疏水作用力及范德华力等多种作用力的协同作用。

2 常用研究方法

有关药物小分子与蛋白质相互作用的研究,目前已有多种方法与技术被引入此研究领域,比如紫外-可见吸收光谱、拉曼光谱、荧光光谱、傅里叶转换红外光谱、核磁共振、质谱、电化学、渗析、微量热技术等等。综合运用各种方法和手段可以得到有关药物小分子-蛋白结合的各种信息。

2.1 紫外-可见吸收光谱法

紫外-可见吸收光谱法是研究小分子与蛋白质相互作用的一种最方便的技术。小分子与蛋白质的相互作用会引起吸收带的红移(蓝移)现象或增色(减色)效应。吸光度减小、吸收带红移以及等吸收点的形成是小分子与蛋白质发生相互作用的光谱标志,据此可以进行定性定量分析。文献[9]发现向芦丁溶液中滴加白蛋白时,芦丁的特征吸收峰(350 nm)随着白蛋白浓度的不断增加,逐渐向长波方向移动。这种光谱变化反映出芦丁分子与白蛋白之间发生了相互作用,芦丁的最大吸收峰红移说明其在白蛋白上结合后,其所处结合部位的极性加白较外部水溶液中减小,分子中π→π跃迁发生红移现象。文献[10]实验中向盐酸多环西素中滴蛋白时,随着白蛋白浓度的不断增加,盐酸多环西素的紫外可见光谱的吸收强度降低,这也说明小分子与蛋白发生了相互作用。紫外吸收光谱一般与荧光发射光谱相互补充,利用二者图形的重叠部分,按照能量转移原理求出小分子与蛋白之间的结合距离。

2.2 荧光光谱法

荧光光谱法是研究小分子与蛋白质相互作用的主要手段,这种方法无论是定性还是定量研究上都获得了成功。它是19世纪发展起来的一种分析方法,具有灵敏度高、选择性强、用样量少、方法简便等优点。蛋白质能够发出荧光,是因为蛋白质中存在三种芳香族氨基酸残基-色氨酸(Trp)、酪氨酸(Try)、苯丙氨酸(Phe)。蛋白质的荧光通常在280 nm或更长的波长被激发,而Phe在绝大多数实验条件下不被激发,所以很少能观察到,通常荧光强度比为100∶9∶0.5[11]。因此,认为蛋白质所显示的荧光主要来自色氨酸残基,而且含色氨酸残基的蛋白质的天然荧光及其变化值可以直接反映蛋白质中色氨酸残基本身和周围环境的变化。另外,荧光光谱可以提供激发光谱、发射光谱以及荧光强度等许多物理参数,这些参数从各个角度反映了小分子与蛋白质大分子的成键和结合情况。通过这些参数的测定,不但可以做一般的定量分析,而且可以推测小分子与蛋白质作用的机理。如通过药物小分子对蛋白质内源荧光的猝灭现象,确定猝灭机理及猝灭常数,可以了解药物和蛋白的作用机理和作用强度。根据能量转移原理,可以求出结合于蛋白的药物分子距离蛋白色氨酸残基的距离。另外,通过药物分子与结合部位已知的荧光探针竞争蛋白结合部位,可以确定药物在蛋白上的结合部位。所以认为荧光光谱法是研究蛋白质的有效方法[12-17]。

小分子与蛋白质作用时,可引起体系荧光性质的改变,有两种情况：⑴小分子无荧光,在蛋白质溶液中加入小分子后,蛋白质的内源荧光被猝灭;⑵小分子有荧光,蛋白质与小分子混合后,其内源荧光被猝灭,同时小分子的荧光被敏化增强。在用荧光光谱法研究小分子与白蛋白的作用时,某些小分子在蛋白质的荧光激发波长和发射波长处有吸收,影响荧光强度的测量,即内滤光效应。文献[18]提出了荧光校正方法。

除了常用的荧光分析方法,近年来还涌现了一些荧光光谱的新方法。如同步荧光光谱法和三维荧光光谱法。同步荧光技术是在同时扫描激发和发射波长时获得的荧光光谱图。药物分子与蛋白作用时,常伴随有蛋白构象的变化,因此可以了解药物分子对蛋白质构象的影响。Δ λ=15 nm作出的同步荧光光谱只显示蛋白质酪基酸的荧光,Δ λ=60 nm时的同步荧光光谱仅表现色氨酸残基的荧光。因氨基酸残基的最大吸收波长与其所处环境的极性有关,故由氨基酸发射波长的改变可以判断蛋白质构象的变化。若发射波长红移表明氨基酸残基所处环境的极性增加,则蓝移疏水性增加。三维荧光光谱法是由激发波长(Y轴)—发射波长(X轴)—荧光强度(Z轴)三维坐标所表征的矩阵光谱。其比二维的平面图多了一个坐标,所得的总荧光数据又比普通荧光光谱多得多,故其具有高选择性。可见,与普通的荧光技术相比,同步荧光光谱、三维荧光光谱法有很多优点。

2.3 核磁共振法和质谱法

核磁共振法可应用于蛋白质构象和性质的研究[19-20],并能够得到的结构信息类型包括蛋白-小分子复合物的构象、与生物大分子发生反应的配体的质子化状态及配体的结合位点的位置和结构。但此法不适宜定量研究结合参数。

质谱分析是在真空系统中将样品分子离解成带电的离子,通过对生成的离子的质量和强度的测定来进行样品成分和结构分析的一种方法。最近几年电喷雾质谱的发展使得质谱在生物大分子研究中得到广泛应用。ESI作为一种最软的电离方法,它能在不破坏蛋白与小分子、蛋白与蛋白形成的复合物的条件下检测出这些复合物的存在[21]。使用ESI-MS检测弱的非共价复合物时要特别注意溶液条件和一些参数的选择。为减少在溶液状态下非特异性静电作用和氢键聚合物的形成,建议使用高浓度的缓冲盐溶液。不过,ESI检测到的小分子与蛋白质是在气态环境下的作用情况,而人体内的生物大分子与小分子作用的环境是液态环境。同时,ESI仅仅只能直观地观察到小分子与蛋白质的复合物,无法推导它们之间的作用机理。将质谱法和核磁共振法联用,能对药物-蛋白的结合作用进行多层次、全方位研究,可同时获得配体的亲和势、化学计量学及结构的相关信息[22]。

2.4 电化学分析法

近年来,电化学分析方法在小分子与蛋白质相互作用中也得到广泛的应用[23-24]。它作为一个很活跃的领域,其研究方法也处在不断的发展中,如循环伏安法、线性扫描伏安法、常规脉冲法、差示脉冲法、计时电量法等等。电化学方法在研究小分子与蛋白质相互作用时,主要是根据小分子与蛋白质作用前后氧化还原峰电流的变化、峰电位的移动进行分析研究的。对于一些吸收光谱比较弱或者与蛋白质作用前后光谱变化不明显,无法用紫外可见、荧光等光谱手段来研究的分子,有可能用直接或者间接电化学方法进行研究,从而获得其他分析方法无法得到的信息。不过,电化学分析法在一定程度上受分子电活性的限制,另外其需样量稍大,背景信号干扰相对较强,而采用蛋白质修饰电极的方法将有助于此类问题的解决。

2.5 微量热法

微量热法在测定过程中不会干扰生物体系的正常代谢活动,对反应体系的光谱性质、电学性质及溶剂性质等无任何条件限制。药物-蛋白质结合过程的热力学性质变化可用量热法直接测定,在测定过程中也不需要添加任何试剂,故其有独特之处[25]。常用的微量热法有常规和差示扫描量热(DSC)法等,这些方法已先后被用于一些抗肿瘤药物、生物染料、药物小分子与DNA或者蛋白质的相互作用的研究中。如易平贵等[26-27]采用混和流动量热方式研究了药物小分子环丙沙星(ciprofloxacin,CPFX)、金霉素(Chlortetracycline,CTC)等与BSA结合反应的热力学性质,结果表明：随着药物的不同,反应的热力学性质稍有差异。

2.6 其他方法

在研究小分子与蛋白质相互作用的方法中,除了上述方法外,还有圆二色谱法、平衡透析法[28-29]、薄层色谱法、超滤法[30]及蛋白质结构模拟[30-32]等方法。

总之,对蛋白质结构了解的越清晰,小分子-蛋白质相互作用的研究也愈来愈明朗,新的测试方法的出现,更推动此类研究的进展。但是值得注意的是：目前仅仅用一种方法是远远不能满足科学的发展的,必须综合运用各种实验方法和手段进行全方位的研究才能得到更加可靠的结论。

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