鼻咽癌组织中 P-Akt的表达及其临床意义

李宇清,杨惠玲

鼻咽癌 (nasopharyngeal carcinoma,NPC)是严重威胁人类健康的一种恶性肿瘤。中国是鼻咽癌的高发国之一,我国的总发病率约占全世界的 80%,南方发病率高于北方,尤其是广西、广东、福建、湖南等省,发病率高的地方可达到 15/10万 ～30/10万。由于鼻咽癌的发病部位隐蔽,早期癌往往没有症状,鼻咽癌患者自己很难发现,直至发现一些症状到医院检查时,80%的患者已是晚期。鼻咽癌的治疗效果与临床分期存在很大关系[1],Ⅰ期患者在放射性治疗之后 5年生存率可达到 90%以上;而晚期患者的 5年生存率仅 8%～10%[2]。为了提高鼻咽癌的诊治水平,建立快捷有效的检测方法,寻找能够用于早期诊断、判断预后和治疗观察,且具有高灵敏度和特异度的标志物十分必要。本研究从蛋白水平检测肿瘤相关分子P-Akt在鼻咽癌组织中的表达,明确其在鼻咽癌组织和非肿瘤鼻咽组织中的表达差异。通过对此蛋白分子与鼻咽癌临床病理因素相关性研究,探讨其在鼻咽癌发生、发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 病例入选标准 病例选取的条件包括:患者术前均未行放、化疗,术后均有明确的病理学诊断;免疫组化实验之前,HE染色片请资深病理教授确诊为鼻咽癌,组织学分类明确;鼻咽癌的临床分期检查至少要包括:常规体格检查、常规实验室检查、胸部 X线检查,腹腔 B超,必要时头颈部 MRI和 (或)CT、全身放射性核素骨骼扫描和内镜检查;有完整的术后随访资料。

1.2 一般资料 筛查广州医学院第二附属医院病理科 2002—2003年鼻咽癌的患者资料,从中选择了符合上述条件的 60例鼻咽癌患者;另外选取同期行病理活组织检查的 30例非肿瘤 (鼻咽慢性炎症)患者做对照。鼻咽癌组中,男 44例,女16例,男女比例为 2.75∶1;年龄 17～87岁,平均 46.0岁。对照组中男 19例,女11例,男女比例为 1.73∶1;年龄 18～79岁,平均 44.3岁。两组患者性别、年龄间有均衡性。

根据 1991年 WHO鼻咽癌组织学分型标准对鼻咽癌患者进行组织学分型,60例均为非角化型鳞状细胞癌 (non-keratinizing squamous cell carcinoma),其中分化型 (differentiated)49例,未分化型(undifferentiated)11例。

1.3 鼻咽癌 TNM分期 2003版美国肿瘤联合会 (American joint committee on cancer,AJCC)和国际抗癌联盟 (International union against cancer,UICC)鼻咽癌 TNM分期法:T1(肿瘤局限于鼻咽腔内)29例,T2〔肿瘤侵犯鼻腔和 (或)口咽,T2a无咽旁间隙侵犯,T2b有咽旁间隙侵犯〕9例,T3〔肿瘤侵犯颅底骨质和(或)鼻旁窦〕17例,T4(肿瘤侵犯颅内、脑神经、下咽、颞下窝、眼眶、咀嚼肌)5例;N0(无颈淋巴结转移)21例,N1(单侧颈淋巴结转移,最大径≤6 cm,位于锁骨上窝以上部位)22例,N2(双侧颈淋巴结转移,直径≤6 cm,位于锁骨上窝以上部位)15例,N3(颈淋巴结转移:a,直径 ＞6 cm;b,锁骨上窝转移)2例;M0(无远处转移)58例,M1(有远处转移)2例。

根据 2003版 AJCC和 UICC鼻咽癌TNM分期法,将鼻咽癌分为 4期:T1N0M0为Ⅰ期;Ⅱ期包括Ⅱa(T2aN0M0)和 Ⅱb(T1N1M0、 T2aN1M0、 T2bN0～1M0);T1N2M0、T2a～2bN2M0、T3N0～2M0为 Ⅲ期 ;Ⅳ期包括 Ⅳ a期 (T4N0～2M0)、 Ⅳ b期(T1～4N3M0)和 Ⅳc期 (T1～4N0～3M1)。本组鼻咽癌患者中,Ⅰ期7例,Ⅱ期 20例,Ⅲ期 25例, Ⅳ期 8例。

1.4 主要试剂 (1)P-Akt抗体,鼠单抗,Cell Signaling公司;(2)小鼠 /兔IgG浓缩型 SABC免疫组化染色试剂盒,武汉博士德生物工程有限公司;(3)山羊 IgG浓缩型 SABC免疫组化染色试剂盒,武汉博士德生物工程有限公司;(4)DAB显色试剂盒,武汉博士德生物工程有限公司。

1.5 方法 选择鼻咽癌组癌组织石蜡标本和对照组的鼻咽组织石蜡切片。采用链酶亲和素 -生物素 -过氧化物酶连结法染色(strept avidin-biotin-enzyme complex,SABC法)进行免疫组化检验。然后由两人双盲法观察切片,在 ×100倍镜下观察切片着色情况,随机选取上下左右中 5个部位,分别在 ×400高倍镜视野下计数。每个视野计数 200个肿瘤细胞中表达的阳性细胞数。综合 5个视野,计算平均值。

1.6 P-Akt阳性标准[3-4]P-Akt阳性着色为粗细不一的棕黄颗粒,主要定位于肿瘤细胞细胞质中。免疫组化染色按阳性细胞数占肿瘤细胞的比例进行分级:细胞质着淡黄至黄色为弱阳性 (+),黄至棕黄色为阳性 (++),棕褐色为强阳性(+++)。

1.7 统计学方法 采用 SPSS 11.0统计学软件包进行统计学处理。计数资料用百分率表示,采用 χ2检验;P-Akt蛋白与鼻咽癌各项临床病理指标之间的关系采用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组鼻咽组织 P-Akt表达水平比较鼻咽癌组织中,P-Akt表达阳性 21例,阳性率为 35.0%,主要定位于细胞质,部分细胞核也呈阳性反应;对照组鼻咽组织中无 P-Akt表达,两组鼻咽组织P-Akt阳性率间差异有统计学意义 (χ2=13.70,P＜0.01)。

2.2 P-Akt表达与鼻咽癌临床病理特征的关系

2.2.1 P-Akt表达与肿瘤原发部位的病变范围及周边组织侵犯程度的关系 鼻咽癌按肿瘤原发部位的病变范围和周边组织侵犯程度分为 T1、T2、T3、T44个等级,P-Akt在 T1、 T2、 T3、 T44个等级癌组织中的阳性率分别是 21%(6/29)、3/9、47%(8/17)和 4/5,差异有统计学意义(H=9.17,P＜0.05)。

2.2.2 P-Akt表达与淋巴结转移的关系

P-Akt在无淋巴结转移 (N0)和有淋巴结转移 (N1～N3)的鼻咽癌组织中阳性率分别为 24%(5/21)、36%(8/22)、40%(6/15)和 2/2,差异有统计学意义(Z=2.14,P＜0.05)。

2.2.3 P-Akt表达与远处转移的关系P-Akt在无远处转移 (M0)和有远处转移 (M1)的鼻咽癌组织中阳性率分别为46%(19/58)和 2/2,差异有统计学意义 (Z=2.72,P＜0.01)。

2.2.4 P-Akt表达与临床分期的关系P-Akt在Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期鼻咽癌组织中的阳性率分别是 1/7、25%(5/20)、44%(11/25)和 4/8,差异有统计学意义 (H=10.74,P＜0.05)。

2.2.5 P-Akt与组织病理学分型的关系

分化型和未分化型鼻咽癌组织 P-Akt阳性率分别为 41%(20/49)和 9%(1/11),差异无统计学意义 (Z=1.43,P＞0.05)。

2 讨论

Akt是细胞质中一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,早在 1977年由 Staal等[5]在研究一种反转录病毒 AKT8时发现。在 1991年作为蛋白激酶 C的同源物而被分离出来,因具有与蛋白激酶 A和蛋白激酶 C同源的序列,故又称为蛋白激酶 B[6]。Akt包括 3个亚型:Akt1(PKBα)、 Akt2(PKBβ)和 Akt3(PKBγ),分别由位于染色体 14q32、19q13和 1q44的基因编码,是一密切相关的同系物。它们在各种组织中广泛表达,但在某些组织中表达具有特异性。

非磷酸化 Akt不具备生物学活性,因此 Akt必须经过磷脂酰肌醇 -3激酶(phos-phoinositide 3-kinase,PI3K)/Akt信号途径磷酸化而激活后才能够促进细胞增殖和抑制细胞凋亡。本研究用免疫组化方法检测活化状态 P-Akt在鼻咽癌中的表达情况。Akt在 PI3K作用下发生活化即磷酸化,生成 P-Akt,PI3K/Akt信号通路参与很多重要生物学过程的调控,但其过度激活可导致肿瘤的发生。因此,P-Akt水平的增加可导致 PI3K/AKT细胞生存通路的活化,促进肿瘤细胞的生长、增殖、侵袭、转移等。可见 PI3K/AKT信号通路失控与人体肿瘤的发生有密切关系。而 AKT的活化形式 P-Akt是该通路起作用的关键,可见 P-Akt的高表达与肿瘤的产生和进展有相关性[7]。

本研究结果显示,鼻咽癌组织 PAkt表达阳性率为 35.0%,而在非肿瘤鼻咽组织中几乎不表达,说明 P-Akt在鼻咽癌组织中过表达。此外,本研究对临床病理资料进行分析,发现 P-Akt与病理组织学分型无关,但 P-Akt在鼻咽癌的表达与肿瘤原发部位的病变范围和周围侵犯情况有关,与鼻咽癌是否发生远处转移及鼻咽癌的临床分期有关,淋巴结侵犯也对 P-Akt在鼻咽癌中的表达有影响。提示 P-Akt可能与鼻咽癌的发生、发展有关,而且随着肿瘤出现局部浸润和淋巴转移、临床分期由早期到晚期,P-Akt表达更为活跃,蛋白表达水平更高,提示 P-Akt蛋白与鼻咽癌的恶性程度和转移进展有关。可见 P-Akt蛋白有可能用于临床鼻咽癌病情和预后的判断。而 P-Akt蛋白表达阳性除了与鼻咽癌的原发灶情况、淋巴结转移、临床分期有关外,还与远处转移相关,这提示 Akt的活化与肿瘤的侵袭性关系更为密切,可能是 PI3K/Akt信号转导途径过度激活干预肿瘤细胞凋亡,导致肿瘤细胞存活和过度增殖,在肿瘤细胞恶性行为中发挥作用[8]。

综上所述,P-Akt参与了肿瘤的发生、发展,P-Akt水平可能有助于临床判断鼻咽癌患者的预后,并有可能为鼻咽癌的治疗提供新的靶点。有必要进一步研究探讨抑制过度激活的 PI3K/Akt信号转导通路能否对肿瘤细胞的增殖有负性调控作用。

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2 Shen C,Lu JJ,Gu Y,et al.Prognostic impact of primary tumor volume in patients with nasopharyngeal carcinoma treated by definitive radiation therapy[J].Laryngoscope,2008,118(7):1206-1210.

3 Liang J,Zubovitz J,Petrocelli T,et al.PKB/AKT phosphorylates p27,impairs nuclear import of p27 and opposes p27-mediated G1 arrest[J].Nat Med,2002,8(10):1153-1160.

4 Moreira JM,Ohlsson G,Rank FE,et al.Down-regulation of the tumor suppressor protein 14-3-3sigma is a sporadic event in cancer of the breast[J].Mol Cell Proteomics,2005,4(4):555-569.

5 Staal SP,Hartley JW,Rowe WP.Isolation of transforming murine leukemia viruses from mice with a high incidence of spontaneous lymphoma[J].Proc Natl Acad Sci USA,1977,74:3065-3067.

6 Jones PF,Jakubowicz T,Pitossi FJ,et al.Molecular cloning and identification of a serine/threonine protein kinase of the secondmessenger subfamily[J].Proc Natl Acad Sci USA,1991,88(10):4171-4175.

7 Cantley LC.The phosphoinositide 3-kinase pathway[J].Science,2002,296(5573):1655-1657.

8 Kim CS,Vasko VV,Kato Y,et al.AKT activationpromotes metastasis in a mouse model offollicular thyroid carcinoma[J].Endocrinology,2005,146(6):4456-4463.