需氧菌与厌氧菌混合感染致糖尿病足一例病原学检测

陈丽丹,石玉玲,曾兰兰

1 病例简介

患者,男,44岁,有糖尿病病史,因 “右下肢进展性红肿、溃疡、流脓、坏死伴疼痛 1月”入院。患者于 2009年8月 10日左右劳作中被铁片刺伤,足跟部出现破溃,逐渐形成溃疡,右足肿胀明显,自行在社区诊所清创,效果不佳,足跟处脓肿扩大,脓液较多,8月底红肿逐渐向上蔓延,右下肢外侧皮肤可见皱起、水疱、破溃伴有坏死表现,散发较浓重的腥臭味,疼痛加重。9月 2日于外院就诊,入院时下肢红斑肿胀仍未控制,继续向上蔓延,皮肤表面出现黑色坏死,足底部溃疡挤压后可见大量气泡溢出,体温升高,诊断为 “右足外伤并产气荚膜杆菌感染”,入院后给予 “头孢他定、左氧氟沙星”抗感染治疗,局部疼痛稍有缓解,但病情仍继续发展,9月 16日转入我院。查体发现右下肢肿胀明显,右侧足跟处可见一 3.5 cm×3.5 cm的溃疡,边界不清,有较多稀薄脓液流出,腥臭味明显,挤压后可见大量气泡溢出。右大腿及小腿可见皮下气肿,触之可扣及捻发音,从足底至右侧腰际部均可触及.大腿外侧可见大片糜烂,其上有 2～3处约 5 cm×5 cm的黑斑,右下肢触痛明显。入院后测餐后血糖为 30.8 mmol/L,给予胰岛素静脉滴注,次日清晨空腹血糖降为 10.0 mmol/L。请骨科、高压氧科及普外科会诊,会诊后均考虑为 “气性坏疽”,建议行手术治疗。检验科细菌室床边取材,在对伤口进行消毒后,将棉签钻入伤口取分泌物及时接种于厌氧血平板、普通血平板、疱肉培养基等,同时涂片。并取少许分泌物用于荧光PCR检测。

2 病原学检测方法

2.1 细菌培养 普通培养及厌氧培养同时进行,对厌氧培养菌进行两次耐氧实验确证为专性厌氧菌。需氧菌的鉴定采用法国梅里埃 VITEK-2 COMPECT全自动生化鉴定仪;厌氧菌的鉴定采用梅里埃的API20A鉴定条。

2.2 荧光 PCR (1)从临床标本中提取 DNA,制备模板。 (2)探针序列为:5′-[FAM]TCATCATTCAACCAAAGGAGCAATCC[TAMRA]-3′, 引物 1序列为:5′-CGCATAACGTTGAAAGATGG-3′, 引物 2序列为:5′-CCTTGGTAGGCCGTTACCC-3′。(3)PCR体系:5 μl缓冲液;1μl dNTPs;引物 1、2各 1μl;0.6μl探针;0.2μl Taq酶及 2 μl细菌DNA模板,无菌双蒸水补足体积 25μl。(4)Roche Light Cycler 480全自动荧光定量 PCR扩增仪,程序:95℃5 min,95℃ 15 s、55℃20 s、72℃20 s、在 55℃时采集荧光,重复 40个循环。阳性对照为产气荚膜梭菌 ATCC13124;阴性对照为大肠埃希菌 ATCC25922,

3 检测结果

3.1 革兰染色结果 伤口分泌物涂片镜检可见大量革兰阳性球菌、革兰阴性杆菌及白细胞。普通血平板培养分离到两种阳性球菌,厌氧血平板培养可见多种细菌生长,分离纯化并进行耐氧实验 (即同时接种需氧及厌氧血平板)。最终分离到专性厌氧菌两株,兼性需氧菌两株,经过鉴定厌氧菌为多毛拟杆菌、消化链球菌;需氧菌为粪肠球菌和鸟肠球菌。

3.2 综合分析仪器给出的各项数据,设定合理的阈值和基线 基线选取 2～6或3～7个循环,阈值线选在阴性扩增曲线的上方。仪器自动生成标准曲线,并计算出样本的结果。若扩增曲线显示有抬高,CT值 ＜36个循环,认为标本中产气荚膜梭菌阳性;若扩增曲线无抬高或 CT值≥36个循环,认为标本中产气荚膜梭菌阴性。本患者伤口棉拭子及伤口引流液检测产气荚膜梭菌均为阴性,阳性对照、阴性对照均在控。

4 讨论

糖尿病足病理基础是糖尿病的神经病变和血管病变,两者和感染一起决定了糖尿病足病变的严重程度。而糖尿病足溃疡的创面中,由于其渗出物中蛋白及糖的含量高,有利于细菌生长,极易合并感染,是导致坏疽,继而致残、致死的重要因素。5%～10%的糖尿病足患者需进行截肢手术[1]。气性坏疽常由产气荚膜梭菌等厌氧菌侵袭伤口,导致严重感染,以组织坏死、水肿产气、全身中毒为特征,气性坏疽的潜伏期从 8 h至 3周不等,但多为 1～4 d。伤口处皮肤开始为苍白色,逐渐变成红色或青铜色,周围有明显肿胀,触诊坚硬;局部可出现水疱,水疱液可澄清或为血色;伤口周面可扪及捻发音,挤压可有恶臭气体溢出,并有浆液样血性分泌物流出。气性坏疽的病原体分离:取患者的伤口渗出液或水疱液,进行革兰染色,可见大量革兰阳性杆菌,偶见极少量的白细胞。若出现大量白细胞则提示合并其他细菌感染[2]。

该患者伤口分泌物涂片可见大量白细胞,并可见大量阳性球菌及阴性杆菌,而未见革兰阳性杆菌。尽管从临床症状分析多数医生考虑气性坏疽,但病原学上并不支持该观点。首先患者发病部位由足跟至腰部,发展时间已超过 1个月,若为产气荚膜梭菌,其繁殖速度迅猛,若条件适宜(低氧化还原电势或低酸碱度)感染可在1 d内蔓延至患者全身,引起休克甚至死亡。其次荧光定量 PCR灵敏度极高,只要标本中细菌含量超过 10 CFU均可被检出,而本次检测结果为产气荚膜梭菌阴性,提示标本中不含有该菌。从患者伤口分离到的厌氧菌为多毛拟杆菌、消化链球菌;需氧菌为粪肠球菌、鸟肠球菌,提示该患者的足部溃烂是由多种需氧及厌氧菌混合感染所致。及时的抗菌治疗和联合用药可减少截肢发生的可能性和病死率[3]。该患者在接受高压氧及抗菌治疗后已出院,在之后的随访中患者的病情有所好转。

本病例提示多种细菌感染特别是混合厌氧菌感染时可同样表现出皮下肿胀、腥臭味及捻发音。因而在临床怀疑气性坏疽时应行快速涂片查找阳性杆菌或荧光定量PCR快速检测产气荚膜梭菌,确实有病原学证据时再行相应处理,避免因误诊导致患者截肢。

1 胡仁明,朱禧明 .糖尿病 [M]//陈灏珠 .实用内科学 .12版 .北京:人民卫生出版社,2005:1015-1026.

2 陈军,卢洪洲 .气性坏疽的诊断与治疗[J].诊断学理论与实践,2009,8(1):111-113.

3 蔡健 .糖尿病足感染的细菌学与药敏分析[J].疑难病杂志,2006,5(5):368.