联合检测ΔNp63、Ki-67和VEGF与膀胱移行细胞癌预后的相关性研究

伍 季，苟 欣，李云祥

(1.川北医学院第二临床学院泌尿外科，四川 南充 637000;2.重庆医科大学附属第一医院泌尿外科 400162)

膀胱癌是人类常见的一种恶性肿瘤，约占全部恶性肿瘤的3%，在我国其发病率居泌尿生殖系肿瘤的首位。目前临床常用的方法难以准确预测膀胱癌的生物学行为及预后。近年来许多肿瘤标记物相继被发现可用于膀胱癌的预后判断，但迄今为止几乎没有标记物可供临床常规使用。目前有研究表明，ΔNp63与膀胱癌的生物学特性有一定的相关性，但其作用存在争议。本实验目的在于通过联合检测和分析ΔNp63、Ki-67和血管内皮生长因子(VEGF)在膀胱癌组织中的表达情况以探讨其在膀胱癌发生发展中可能的作用及其相关性。

1 材料与方法

1.1 一般资料 选取川北医学院第二临床学院病理科2006～2008年经手术切除的并有完整临床资料的膀胱移行细胞癌(TCCB)标本56例，其中男34例，女 22例，年龄 30～82岁，平均56岁。病理分级按世界卫生组织(WHO)1998年标准确定，低级别(0～Ⅰ级)37例，高级别(Ⅱ ～Ⅲ级)19例。临床病理分期按国际抗癌联盟TNM分期(UICC-TNM)标准确定，分为浅表性肿瘤(Tis～T1)32例，浸润性肿瘤(T2～T4)24例;初发30例，复发26例。以12例膀胱切开取石术及开放前列腺切除术患者的膀胱黏膜为对照组。

1.2 方法 应用免疫组织化学染色的方法，对患者的病理切片进行ΔNp63、Ki-67和 VEGF染色。鼠抗人 ΔNp63 Ig G单克隆抗体、鼠抗人 Ki-67核抗原、羊抗人 VEGF多克隆抗体、免疫组织化学染色SP试剂、DAB显色试剂盒购自北京中山生物制品有限公司。按试剂盒说明书操作。

1.3 结果判定 由2位病理科医生在临床和病理资料不知晓的情况下进行观察，2位观察者重复观察同一张病理切片进行结果判定。随机选择5个高倍视野，计数500个肿瘤细胞中阳性染色细胞，阳性表达率(PI)=(阳性表达肿瘤细胞数/500)×100%，ΔNp63抗原阳性表达表现为细胞核内出现棕黄色颗粒，PI＜25%为阴性，PI≥25%为阳性(图1)。Ki-67阳性表达表现为肿瘤细胞核内出现棕黄色颗粒，以PI＜20%为阴性，≥20%为阳性(图2)。VEGF阳性表达以肿瘤细胞及其附近的血管内皮细胞胞质出现黄色或棕黄为阳性染色，无肿瘤细胞着色或着色肿瘤细胞数小于10%为阴性表达，着色肿瘤细胞数大于或等于10%为阳性表达(图 3)。

表1 ΔNp63、Ki-67和 VEGF的染色结果(n)

1.4 统计学处理 使用S PSS10.0版统计软件作统计分析，ΔNp63、Ki-67和VEGF在膀胱癌中的表达及与临床分期、病理分级的关系采用χ2检验，各指标阳性表达相关性分析采用S pearman等级相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 ΔNp63、Ki-67和VEGF的表达与膀胱癌病理分级、分期及预后的相关性 ΔNp63、Ki-67和VEGF在正常膀胱黏膜、不同分级及不同分期膀胱癌组织中的阳性表达率见表1，结果表明，随癌细胞恶性程度及浸润程度增加，ΔNp63、Ki-67、VEGF的阳性表达有增强趋势，其差异有统计学意义(P＜0.05);ΔNp63、Ki-67、VEGF在复发组中的表达均明显高于初发组，其差异有统计学意义(P＜0.05)。

图1 ΔNp63在 TCCB中的阳性表达

图2 Ki-67在TCCB中的阳性表达

2.2 ΔNp63与VEGF、Ki-67在 TCCB中表达的相关性ΔNp63、Ki-67和VEGF在膀胱癌组织中的表达情况经分别采用Spearman等级相关性分析，ΔNp63与 Ki-67、ΔNp63与VEGF均呈正相关，rs′分别为 0.316、0.322，其差异有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

表2 ΔNp63与Ki-67、VEGF的相关性分析(n)

图3 VEGF在TCCB中的阳性表达

3 讨 论

p63是p53的家族成员之一，主要有 TAp63和 ΔNp63两种亚型。p63在尿路上皮的分化和膀胱癌发生中起着一定的作用[1]。TAp63功能类似 p53，ΔNp63亚型无 TA区，不具备转录激活活性，是缺乏酸性 N端反式激活区的 p63，ΔNp63以显性失活的方式抑制 TAp63和 p53，主要与细胞增殖有关[2]。ΔNp63在膀胱癌中的作用存在争议，Park等[3]研究证实，ΔNp63在膀胱癌中表达增强，提示ΔNp63可能促成膀胱癌的进展 。Compérat等[4]研究证实，p63的表达在膀胱癌进展期间，尤其从低级别向高级别转化过程中逐渐下降。何云锋等[5]研究认为，ΔNp63与 TCCB的发生密切相关，可能为 TCCB发生的重要促进因素，但其表达水平和TCCB的临床分期、病理分级没有相关性，故ΔNp63在TCCB进展中的作用有待进一步研究。本实验结果显示，ΔNp63在TCCB中的阳性表达率显著高于正常膀胱组织，并且与肿瘤的浸润程度和病理分级呈正相关，在复发组的表达率显著高于初发组，其差异均具有统计学意义(P＜0.05)。随癌细胞恶性程度及浸润程度增加，?ΔNp63阳性表达有增强趋势。

ΔNp63与膀胱癌进展的作用机制目前尚不清楚。研究表明，Ki-67是一种增殖相关核抗原，与细胞周期密切相关，是判断肿瘤预后的重要标记物，其表达越高预后越差[6]。Ki-67高表达的膀胱癌分化程度低、浸润性强，可准确反映细胞增殖状况，是研究肿瘤生物学行为和预后的一个重要参考指标[7]。而VEGF是内皮细胞特异的有丝分裂原，参与肿瘤营养血管的发生和构建，VEGF和表浅性膀胱癌的生物学行为最为密切，可作为表浅性膀胱癌的相对特异的指标。Yang等[8]取161例膀胱癌样本用免疫组化的方式研究VEGF基因的表达情况，结果显示，随着临床分期、分级的增高，VEGF基因表达的阳性率明显提高。本实验结果显示，ΔNp63、Ki-67和 VEGF在 TCCB中的阳性表达与肿瘤的浸润程度、病理分级及预后呈正相关，ΔNp63可能通过促进肿瘤细胞的增殖和肿瘤血管形成发挥促癌作用，ΔNp63表达越强，细胞增殖越活跃，肿瘤的恶性程度越高，浸润性生长和复发的可能性越大。

膀胱癌的预后判断一直困扰着临床医生，临床上采用的病理分级、分期方法曾为临床提供了有益于判断预后的资料，但仍很难准确预测膀胱癌的生物学行为及预后。近年来随着对肿瘤分子生物学机制认识的深入，许多膀胱癌的预后判断标记物相继被发现，但迄今没有任何一种标记物常规应用于临床。膀胱癌的发生和发展是多因素、多基因影响的复杂过程，仅凭单一的肿瘤标记物不能全面准确地反映肿瘤的恶性潜能。一些学者进行了多指标联合检测判断膀胱癌预后的研究，周占松等[8]检测了p21、p185、p53蛋白在膀胱癌肿的表达，说明多个基因协同激活在膀胱移行细胞癌发生、发展中起一定作用。温机灵和周祥福[9]认为联合检测 p53、p21、Ki-67和VEGF可以更加准确地预测膀胱癌的预后。Khaled等[10]经多因素分析显示联合检测nm23-H 1、EGFR和p53是能用于预测高风险膀胱癌的生物学指标，并且认为除病理学因素外，联合检测2个或2个以上标记物对判断预后有协同作用。本实验采用免疫组化检测了ΔNp63、Ki-67和VEGF在TCCB中的表达。结果显示，由于ΔNp63在尿路上皮的分化中起重要作用，并且扮演了癌基因的角色，Ki-67是一种增殖相关核抗原，反映了肿瘤细胞增殖状况，VEGF参与肿瘤营养血管的发生和构建，为肿瘤生长、浸润和转移提供适宜的条件。结果表明，ΔNp63、VEGF和Ki-67表达水平及与TCCB分化程度、浸润程度及预后呈正相关，三者在膀胱癌的发生和发展过程中可能有协同作用，三者表达越高，肿瘤细胞的生长越活跃，发生浸润和转移的概率就越大，预后越差。联合检测ΔNp63、Ki-67和VEGF在膀胱移行细胞癌中的表达有助于膀胱癌的预后判断，并为临床治疗选择提供帮助。

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