miRNA在肿瘤研究中的进展

陈军莹综述，姚德生审校

(广西医科大学附属肿瘤医院妇瘤科，南宁 530021)

微小RNA(miRNA)最早在线虫中被发现[1-2]，结构上主要有3个特点:(1)本身不具有开放阅读框架(ORF)及蛋白质编码基因的特点;(2)通常的长度约为22个核苷酸;(3)有独特的特征序列。很多学者认为miRNA对其靶基因主要为抑制作用，但是，2007年，美国哈佛医学研究所在研究ARE的调控作用中发现，miRNA有活化翻译的作用，即在细胞周期的调控中上调靶m RNA的翻译[3]。在细胞周期停滞的情况下，识别TNF alpha m RNA中ARE的miRNA369-3能够上调或活化m RNA的翻译。通过构建其他3′UTR的报告基因，发现其他几个miRNA同样在细胞周期抑制的情况下活化基因的翻译:let-7能够活化含有H MGA23′UTR报告基因的翻译;人工合成的miRcxcr4能够活化3′UT R含有其识别位点的报告基因的翻译。2008年，Orom等[4]发现与大多数miRNA总和m RNA 3′端结合的概念不同，miR-10a能与核糖蛋白的m RNA的5′TOP M otif功能性结合，并增强其翻译。从这些研究结果看来，miRNA在功能发挥中可能只是起靶向识别的作用，而发挥何种功能则是由其结合位点和相应的结合蛋白决定。

1 miRNA与肿瘤的关系

miRNA在肿瘤中的作用主要在血管再生、细胞调亡、侵袭/转移、细胞增殖、肿瘤发生几个方面，近年来的一些报道见表1，由于miRNA与肿瘤的关系如此密切，以至于研究者们直接称之为癌基因miRNA或抑癌基因miRNA。在大多数情况下，失调控的miRNA始终只上调或下调，但也存在一些不寻常的情况，例如，miR-181家族的成员在某些肿瘤中是上调的，如甲状腺、胰腺癌和前列腺癌[5]，但在另一些肿瘤中却是下调的，如胶质母细胞瘤和垂体腺瘤[6-7]。

表1 部分miRNAs功能

2 癌基因miRNA

2.1 miR-17-92簇 miR-17-92簇是定位于人染色体13q31的多顺反子miRNAs[20]，共包括7个成熟 miRNAs分子:miR-17-5p、miR-17-3p、miR-18、miR-19a、miR-20、miR-19b-1、miR-92-1。miR-17-92簇的表达水平在肿瘤组织中显著升高，与多个癌基因或抑癌基因密切相关:(1)癌基因c-Myc。Olive等[21]用小鼠B细胞淋巴瘤Emu-myc模型，功能解剖miR-17-92簇单个组件发现:miR-19能够激活Akt-m TOR通路，对抗pten蛋白，同时协同癌基因C-Myc，诱导细胞增殖，这些都证明miR-19是miR-17-92簇群中最重要的癌基因分子。Mu等[22]通过特定敲除miR-17-92的等位基因片断实验证实，在c-Myc诱导B细胞淋巴瘤的机制中，持续表达内生型miR-17-92是必不可少的条件，同时也证实，miR-19a和 miR-19b是 miR-17-92簇中绝对、充分的具有决定意义的癌基因miRNA。(2)抑癌基因PTEN。Xiao等[23]在小鼠的动物实验中植入 miR-17-92高表达的淋巴细胞后，这些小鼠患淋巴细胞增生性疾病和自身免疫性疾病并过早死亡，有作者认为可能为miR-17-92抑制pten基因和促凋亡蛋白Bim。(3)抑癌基因 RB2。Wang等[24]发现miR-17-92与脂肪细胞分化有关，将miR-17-92稳定转染至小鼠脂肪前细胞3T3L 1中，使得细胞分化，同时发现Rb2/p130 m RNA和蛋白数量在随后的增殖阶段中减少，使用siRNA敲减3T3L 1克隆增殖阶段的Rb2/p130后，3T3L1细胞重现高水平miR-17-92;表明miR-17-92通过靶基因Rb2/p130影响细胞分化。(4)抑癌基因 p53。Yan等[25]发现在大肠癌中，miR-17-92簇与p53呈负相关，在包含野生型p53的低氧处理细胞中，miR-17-92减少，但在不含p53的低氧处理细胞中，miR-17-92水平不变，检测发现miR-17-92与p53存在绑定位点，同时，miR-17-92的高表达抑制缺氧情况下的细胞凋亡，这都表明miR-17-92是p53在缺氧情况下的靶分子。

2.2 miR-21 MiR-2l位于染色体17q23.2上的空泡膜蛋白基因的3′UTR区，该区域经常在神经细胞瘤、乳腺癌、结肠癌和肺癌中表达增强，miR-21也被认为是经典的癌基因 miRNA:(1)在神经系统肿瘤中的研究表明，miR-21在恶性胶质瘤中的表达水平明显上调，下调miR-21的表达可以触发caspases的激活，从而导致肿瘤细胞的凋亡。最近有研究证明星型胶质细胞瘤的各个阶段miR-21均升高[26]。(2)miR-21在乳腺癌组织中表达上调。在乳腺癌标本MDAMB-231中PDCD4和maspin的蛋白含量与miR-21的表达呈负相关，抑制miR-21的表达或增加TPM1的表达水平能明显减少癌细胞的侵袭和肺转移[13]。Wickramasinghe等[27]报道，miR-21在雌激素受体阳性的乳腺肿瘤中的表达比阴性的乳腺肿瘤高，证明雌激素能够诱导miR-21的减少，这种抑制是α-ER诱导的，在miR-21受抑制后，其靶基因 Pdcd4、PTEN和Bcl-2蛋白表达增高，使用siRNA敲除α-ER可以阻止这3种基因表达升高。这些结果第一次用实验证明E2通过激活雌激素受体，抑制癌基因miR-21。此外，还有研究表明，在乳腺癌细胞系中，骨形态发生蛋白-6(BMP-6)可以通过降低 deltaEF1和 AP-1来抑制miR-21[28]。(3)在消化系肿瘤的研究中，有研究用原位杂交分析(ISH)发现，miR-21在结直肠癌组织中的表达远远高于正常的结直肠黏膜，同时miR-21的高表达同样可以在与癌症相关的基质成纤维细胞中发现，这些现象提示miR-21的表达可以被肿瘤细胞因子诱导。PDCD4的表达与 miR-21呈负相关，是miR-21的靶基因。在内镜检查中，miR-21在癌组织中的表达远远高于与非肿瘤相关的息肉组织。使用LNA-ISH分析发现，miR-21可以提示癌前病变，并且在结、直肠肿瘤从腺瘤到进展期癌症的过程中持续高表达。Meng等[29]发现，miR-21在肝细胞癌组织中上调，抑制体外细胞中miR-21后，PTEN基因表达上调，同时细胞增殖、侵袭能力下降，中心黏附激酶(FAK)、MMP-9、MM P-2表达下降，表明 miR-21可以抑制PT EN基因。此外，miR-21还通过负调控肿瘤抑制基因——原肌球蛋白1(tropomodulin，TPM1)、程序性细胞死亡4(programmed celldeath 4，PDCD4)和maspin来促进细胞的侵袭转移。(4)Liu等[30]发现，miR-21在喉癌组织中高表达，用特异反义核苷酸敲除喉癌HEp-2细胞中的miR-21后，因为缺失由G1到S期的转换调控，细胞数量减少，凋亡增加。

2.3 miR-10b Ma等[31]证明，miR-10b特异性地增加肿瘤细胞的侵袭，但不影响细胞的生活力和增殖。将过表达miR-10b的乳腺癌细胞系SUM159注射到小鼠乳房脂肪细胞中可以观察到肿瘤细胞簇的肺部微小转移，并有部分细胞转移到胸膜。在乳腺癌细胞系中，miR-10b通过转录因子Twist的作用大量表达，进而抑制其靶基因抑瘤蛋白HOXD10的表达，同时增加介导细胞转移蛋白RHOC的翻译。实验证明，HOXD10的过表达抑制RhoC蛋白的表达水平，能够阻止miR-10b诱导的肿瘤细胞侵袭转移[32-33]。另外，有学者使用RT-PCR技术，对 43例胶质瘤样本和6个胶质瘤细胞系进行检测发现，相比无肿瘤的脑组织，miR-10b在这些标本中均升高，且升高的水平与胶质瘤的恶性程度呈正相关，Rho C蛋白和尿激酶型纤溶酶原激活受体也与 miR-10b水平密切相关(P值分别为 0.009、0.014)。这些数据均提示miR-10b可能在胶质瘤的浸润过程中扮演重要角色。

2.4 miR-155 miR-155由BIC基因(B cellintegration cluster)编码 ，最初是作为转录物从禽白血病病毒ALV的整合位点中分离出来的。人类BIC基因定位于人染色体21q21，含3个外显子，其中第3个外显子编码miR-155。由于缺乏足够长的开放阅读框架，BIC基因不能编码蛋白质，所以其主要功能可能是产生miR-155。BIC基因活化可促进淋巴瘤和非白血性白血病的发病过程，而这两种疾病又与癌基因c-Myc上调有关。miR-155在血液系统疾病中研究较为深入:miRNA-155在霍奇金淋巴瘤和Burkitt淋巴瘤中表达水平明显升高，尤其是在B细胞淋巴瘤中，可出现miR-155前体10～30倍的蓄积现象;而在非霍奇金淋巴瘤中几乎不表达miR-155。miR-155很可能是细胞由炎症进展到肿瘤的重要分子，Tili等[34]发现，许多血液系统疾病可以发现中等程度的miR-155过表达，转入过表达的miR-155可以使小鼠细胞致癌，然而在炎症应答中，有机体可以出现短时间的更高水平的miR-155表达，而为什么持续中等量的miR-155的过表达可以致癌原因不明。在实体瘤的研究中，miR-155是早期胰腺癌的可靠生物标记物[35]，能抑制凋亡激活因子TP53INP 1的活性。乳腺癌中miR-155也存在过表达。有学者通过生物信息学分析，推测细胞因子、化学增活素和转录因子可能都是miR-155的靶点，而最近发现的靶点是SHIP和C/EBPbeta，两个都是白细胞介素-6信号通路上的重要调节因子[36]。

2.5 miR-221及miR-222 人甲状腺乳头状癌(PTC)组织中miR-221和miR-222高水平表达(增高11～19倍)与 KIT基因和蛋白的低表达同时存在，表明miR-221和miR-222对其靶基因KIT的负性调控可能与甲状腺癌的发生有关。Garofalo等[37]通过实验证实，miR-221和miR-222在非小细胞肺癌和肝癌中过表达，它们的靶基因是肿瘤抑制因子PT EN和TIMP 3，通过激活AKT途径促进细胞转移，同时此研究还证明，通过 c-Jun转录因子，癌基因M ET也参与miR-221和miR-222的活化作用。此外，还有研究表明，miR-221和miR-222在血管平滑肌细胞的异常增生中有重要作用，p27和p57是它们的两个重要靶基因[38]。

2.6 miR-372及miR-373 miR-372和miR-373在人类睾丸生殖细胞肿瘤中高表达。Voorhoeve等[39]证实，miR-372和miR-373是通过阻断RAS诱导的老化以及干扰 RAS介导的细胞转化来使细胞对正常表达的p53等位基因所产生效应的敏感性降低，并认为具有正常p53功能的肿瘤组织中可能出现miR-372和miR-373的病理性表达水平升高。为了深入研究这两种miRNA的致癌机制，他们进一步检测了高表达miR-372和miR-373细胞的基因表达谱，发现这2个miRNA可能通过直接抑制肿瘤抑制基因LATS2的表达来阻断p53介导的CDK抑制，从而促进细胞的增殖和肿瘤的生长。而在最近的关于人诱导多能干细胞的研究中，miR-371/372/373簇群表达了更好的组织特异性[40]，有待于进一步的研究。

3 抑癌基因miRNA

3.1 miR-15a/16-1 miR-15a和 miR-16-1，定位于人染色体13q14的LEU 2区域内，在人类慢性淋巴细胞白血病(CLL)中充当着抑癌基因的角色，是最早得到证实的与肿瘤有相关性的miRNA。在CLL患者中，Calin等[41]研究发现68%的C LL病例会发生13q14的缺失，miR-15a和miR-16-1是这个缺失区域内仅有的2个基因，它们的表达水平均下调或缺失。后来有研究结果显示，抗凋亡蛋白 Bcl-2是miR-15a和miR-16-1的靶基因之一，miR-15a和miR-16-1可以从转录后水平负性调控Bcl-2表达。此研究结果提示miR-15a和miR-16-1可以被用来治疗过度表达Bcl-2的肿瘤。现在，已知的miR-15a/16-1的直接靶基因有Bcl-2、MC L1、CCND1、WNT 3A 及miR-15a/16-1[42]，这些研究将为癌症患者(特别是CLL)指引新的治疗方向。

3.2 miR-34 miR-34家族定位在人类染色体1p36，一个在人类肿瘤(如神经母细胞瘤)中常发生缺失的区带[43]。miR-34家族成员(miR-34a和miR-34b/c)是抑癌基因p53的直接靶分子;而p53是人类最常见癌症的突变基因之一，可以激活一系列的转录产物，诱导细胞周期阻滞、凋亡及衰老。在多种癌细胞培养体系的体外研究中(如乳腺癌、非小细胞肺癌等)，无论是外源性还是生理性的应激均可通过p53途径引起miR-34的高表达。许多肿瘤中经常可以发现miR-34a和miR-34b/c基因受到CpG甲基化的影响而失活。miR-34是p53基因信号通路的参与者，过度表达 miR-34至少可以通过CDK 4、CDK 6、cyclinE2、E2F 3、Bcl-2等诱发细胞周期停滞在G1期和抑制细胞增殖及集落形成，诱导凋亡。最近发现，MiR-34、SIRT 1和p53能够形成一个环状反馈机制，SIRT 1是一个调节细胞周期限制细胞寿命的基因，通过脱乙酰作用调控p53，进一步调节miR-34的活性，而miR-34又可以抑制 SIRT 1，形成一个正反馈环，使p53活性提高[44]。

3.3 let-7/miR-98 let-7/miR-98家族无所不在，是最早得到识别确认的哺乳动物miRNA之一，包含12个成员(let-7-a1、a2、a3、b、c、d、e、f1、f2、g、i和 miR-98)，定位于 8 个不同的同源染色体，12个成员有9个不同的let-7序列，但同为一个种子序列，其靶基因存在重叠。已经确认的let-7家族的靶基因包含有细胞周期调节子CDC25A、CDK6、caspase-3，癌基因 RAS、c-Myc，胚胎基因 HMGA2、Mlin-41、IMP-1等等[45]。Let-7发生突变的细胞不能进入正常的细胞周期，不能在正确的时间进行分化。肺癌组织中let-7的表达水平下调，且低表达let-7的患者生存期缩短，这提示let-7可能是一个肿瘤抑制基因。Chin等[46]发现，在非小细胞肺癌患者(74例)中，KRAS基因 3′端Let-7绑定位点的SNP等位基因变异频率为18.1%～20.3%，而健康人群仅占5.8%。Motoyama等[47]使用real-time PCR技术分析了110个胃癌患者高迁移率组A蛋白(HMGA 2)的表达，发现HMGA2在胃癌组织中的表达远远高于正常组织，并且HMGA2的表达与浆膜侵犯、不良预后呈正相关，证明HMGA 2是胃癌的独立预后因子，而let-7-a、let-7-b、let-7-c表达水平与HMGA 2的表达呈负相关，是HMGA2的负调节子。

3.4 miR-143及miR-145 miR-143和miR-145定位于染色5q33.1，被认为，是肿瘤抑制基因，与细胞分化关系密切。最初的研究认为miR-143与脂肪细胞分化有关，当脂肪细胞分化时，miR-143水平升高，当miR-143受抑制时，脂肪细胞的分化受抑，而遗传物质和三酰甘油堆积，其机制可能与ERK5蛋白水平有关。在诱导细胞分化方面，Cordes等[48]证明，miR-143及miR-145在诱导多能干细胞向平滑肌细胞转化中有重要促进作用。Northern免疫印迹分析表明，miR-143和miR-145在结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌、淋巴瘤等细胞系中表达量明显下调 。2009年，Suzuki等[49]发现，野生型 p53基因可以提高miR-143及miR-145转录后活性，而突变型p53基因则减少这些成熟miRNA的表达，进一步的实验发现突变型的p53因为影响了Drosha复合体和p68，导致miRNA合成受抑。

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