EMMPRIN基因增强CT26小鼠结肠癌细胞的转移潜能

戴凌 田小林 谭宁 温海滨 黄岚珍

1.广西桂林医学院附属医院普通外科，广西 桂林 541001；2.广西桂林医学院生物科学实验中心，广西 桂林 541004；3.广西河池市人民医院肾内科，广西 河池 530021

结肠癌的侵袭转移不仅是结肠癌的基本生物学特征之一，亦是临床上绝大多数结肠癌患者的致死因素。原发结肠癌可以进行手术切除或放射治疗，但对于已经播散转移的结肠癌，则往往难以通过上述治疗手段来获得理想的治疗效果。结肠癌的转移与否，对结肠癌治疗效果及预后具有决定性的作用，这也是结肠癌治疗所面临的主要困难与挑战。究其原因，主要有两方面：⑴恶性肿瘤的生物异质性；⑵不同的宿主因素及体内条件差异的存在。

细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN）首先由Ellis等［1］于1989年从人类肺癌细胞LX-1中提纯，曾被命名为肿瘤细胞起源的胶原酶刺激因子（tumor cell-derived collagenase stimulatory factor，TSCF）。但后来的研究发现它同样存在于人类正常组织中，由于能显著诱导基质金属蛋白酶的产生，所以 Biswas等［2］于1995年将其重新命名为细胞外基质金属蛋白酶诱导因子。

在正常生理条件下EMMPRIN广泛存在于人类正常组织中，如角质细胞、胚胎上皮细胞和血管内皮细胞等多种细胞，并参与构成人类的血脑屏障，同时参与创伤愈合、组织修复、妊娠和胚胎发育等众多生理过程［3］。在病理状态如恶性肿瘤等病理过程中，EMMPRIN主要参与细胞和细胞之间或细胞和基质之间的黏附，体外实验发现肿瘤细胞来源的EMMPRIN可刺激人成纤维细胞和内皮细胞分泌产生基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs），从而参与破坏天然组织机械屏障，有助于癌细胞的侵袭及扩散［4-6］。

为了明确EMMPRIN在结肠癌转移中的作用，本研究构建了EMMPRIN的真核表达载体pCMV-HA2-EMMPRIN，并将其转染至结肠癌细胞系CT26，以观察其对CT26细胞转移的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株与质粒 CT26小鼠结肠癌细胞购自中国科学院上海细胞库，真核表达载体pCMV-HA2为本室所藏。

1.1.2 主要试剂与仪器 限制性内切酶及T4连接酶购自Promega公司，Hyclone特级胎牛血清购自Hyclone公司，高糖型DMEM购自Gibco公司，DNA片段回收试剂盒购自Qiagen公司，质脂体LipofectamineTM2000 Reagent购自Invitrogen公司，G418购自Gibco公司，蛋白裂解液、蛋白定量试剂盒及发光底物试剂盒均购自Pierce公司，HA单克隆抗体（鼠源性）购自Santa Cruz公司（工作浓度1∶1 000），Transwell小室（内径6.5 mm，孔径8.0 μm）购自Corning公司，MatrigelTM购自Corning公司，CCK-8购自上海同仁化学有限公司，引物由英骏生物技术有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 CT26细胞用含10%胎牛血清（10% FBS）的DMEM培养基在37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养，培养基中不添加青霉素及链霉素。

1.2.2 载体构建 以登录Genebank后获取的EMMPRIN基因序列（NM_198591.1）为模板，应用Primer5.0引物设计软件设计该基因的CDS区全序列的PCR上、下游引物。该引物序列中已包含内切酶BglⅡ和EcoRⅠ序列以及必要的保护碱基、启始及终止密码。正向引物: 5’-CGAGATCTATGGCGGCTGCGCTGTTC-3’，反向引物: 5’-GCGAATTCTCAGGAAGAGTTCCTCTG-3’。

PCR反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。将PCR产物回收后，与pCMVHA2均用BglⅡ和EcoR Ⅰ（Promega）进行酶切反应。回收酶切产物后将二者进行连接。将连接产物转化TOP10F’感受态细菌，涂板（Amp+），挑取阳性菌落扩增，提取质粒后送英骏生物技术有限公司进行测序。

1.2.3 EMMPRIN基因过表达细胞株的建立将生长状态良好的细胞接种在10 cm培养皿上，待细胞长至70%满度时进行转染。质脂体LipofectamineTM2000 Reagent 10 mL（2 mg/mL）和pCMV-HA2-EMMPRIN（或空载体pCMVHA2）2 mg分别用DMEM稀释到2 mL，二者混合后，在室温放置30 min。用无血清DMEM洗细胞2次，将DNA和脂质体的混合物用无血清DMEM补足到5 mL，转染细胞6 h后，加5 mL 20% FBS的DMEM。48 h后用2 000 mg/mL的G418选择培养液培养，4 d后将G418浓度降低，14 d后将G418浓度降至200 mg/mL。待细胞克隆形成后，将平皿上的单克隆挑入96孔板，继续培养。之后将96孔板内的细胞转入24、12和6孔板培养。用Western blot检测进行鉴定。

1.2.4 Western blot检测 用细胞裂解液提取细胞蛋白（按说明书进行操作），用蛋白定量试剂盒定量（按说明书进行操作）。将蛋白样品用10% SDS聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）进行电泳，每个蛋白样品上样量为10 μg，蛋白进入分离胶后用150 V恒压电泳。用湿转法进行转膜。封闭液（PBST+5%脱脂奶粉）将膜于室温封闭3 h，按工作浓度加入一抗，4 ℃封闭过夜。将膜漂洗3次后，用HRP偶联的二抗室温温育1 h，而后加入化学发光试剂，用X光片曝光显影。

1.2.5 体外侵袭实验 Transwell小室的上室膜上铺Matrigel，50 μg/室（用无血清DMEM稀释），下室加入10% FBS的DMEM培养基。将对数生长期细胞用胰酶消化后，离心后重悬于无血清DMEM培养基，上室内加入5×104个细胞/室，于37 ℃、CO2体积分数为5%的条件下培养。24 h后取出小室进行细胞固定，用结晶紫染色，显微镜下记数穿膜细胞数，每组设3个平行样本。

1.2.6 划痕实验 将对数生长期细胞用胰酶消化后，离心后重悬于无血清DMEM培养基，种入12孔板，3×105个细胞/孔。采用10% FBS的DMEM培养基，于37 ℃、CO2体积分数为5%的条件下培养。24 h后用200 μL枪头在孔内划痕，用无血清DMEM培养基漂洗3次，加入2%FBS的DMEM培养基继续培养24 h。实验终止后将孔内细胞进行固定，用结晶紫染色，显微镜记数并拍照。每组设3个平行样本。

1.2.7 粘附实验 用无血清培养基DMEM将Matrigel配制成0.05 μg/μL的人工基底膜胶备用。96孔板每孔中铺Matrigel 2 μg，放于超净台中风干过夜。使用前每孔加入250 μL预温的含10 g/L BSA的无血清培养基，于37 ℃条件下培养30 min，使基质胶再水化，再吸去剩余培养液。消化处于对数增殖期的细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1～2遍，用10%FBS的细胞培养基重悬细胞，调整细胞密度至1×106个/mL。取细胞悬液加入96孔板，接种细胞数为2×105个/孔，设3个复孔。培养细胞：常规培养1 h。细胞培养1 h后，将细胞悬液吸出弃去后，采用0.1%结晶紫染色，并获取图片；或每孔加入CCK-8混合液200 μL（CCK-8：无血清培养基为1∶9）继续培养2 h，然后吸出CCK-8混合液100 μL在酶标仪450 nm处读取吸光度值。

1.2.8 统计处理 数据采用SPSS 11.5软件建 立数据库。组间差异采用t检验，双侧P<0.05被认为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 真核表达载体pCMV-HA2-EMMPRIN的构建及EMMPRIN过表达细胞株的建立以Genebank登录的EMMPRIN基因序列（NM_198591.1）为模板，应用Primer5.0引物设计软件设计引物，通过PCR方式获得EMMPRIN基因，长度为826 bp（图1A）。将PCR产物回收后，与pCMV-HA2均用BglⅡ和EcoRⅠ（Promega）进行酶切反应。回收酶切产物后将二者进行连接。将连接产物转化TOP10F’感受态细菌，涂板（Amp+），挑取阳性菌落扩增，提取质粒后送英骏生物技术有限公司进行测序。将构建的真核表达载体pCMV-HA2-EMMPRIN，采用脂质体转染法转染CT26细胞，经G418筛选2周后，挑取单细胞克隆，按序进行96孔板、24孔板、6孔板培养。在提取细胞蛋白后，用标签抗体（anti-HA）进行了Western blot检测。在验证了36个单克隆后，鉴定出过表达EMMPRIN基因的细胞株，并命名为EMMPRIN组（图1B）。对照组为空载体pCMV-HA2转染CT26细胞，亦经G418筛选2周。

图1 EMMPRIN基因的获取及EMMPRIN过表达株的Western blot鉴定Fig.1 EMMPRIN gene was obtained through PCR and overexpression of EMMPRIN in CT26 cells was identified by Western blot

2.2 EMMPRIN促进CT26细胞的侵袭 在侵袭实验中，对照组与EMMPRIN组均设3个平行样本，每个样本于10倍物镜下观测中心视野，共计3个视野，发生侵袭的细胞个数分别为：48.67±5.31, 103.33±8.49（图2），差异有统计学意义（P<0.01）。与对照组相比，EMMPRIN基因明显促进CT26细胞的侵袭。

图2 EMMPRIN促进CT26 cells的侵袭Fig.2 EMMPRIN promoted CT26 cells invasion(×100)

2.3 EMMPRIN促进CT26细胞的迁移 在迁移实验中，对照组与EMMPRIN组均设3个平行样本，每个样本于10倍物镜下观测2个视野，共计6个视野，迁移的细胞个数分别为：18.33±2.05和40.67±2.49（图3），差异具有统计学意义（P<0.01）。与对照组相比，EMMPRIN基因能明显促进CT26细胞的迁移。

2.4 EMMPRIN抑制CT26细胞的粘附 在粘附实验中，EMMPRIN组与对照组均设3个平行样本，每个样本于10倍物镜下观测中心视野，共计3个视野（图3），CCK-8吸光度的数据统计结果分别为：2.10±0.22和3.33±0.17（图4），差异具有统计学意义（P<0.01）。与对照组相比，EMMPRIN基因能明显抑制CT26细胞的粘附。

图3 EMMPRIN促进CT26的迁移Fig.3 EMMPRIN promoted CT26 migration(×100)

图4 EMMPRIN抑制CT26的粘附Fig.4 EMMPRIN inhibited CT26 cells adhesion(×200)

3 讨 论

Davidson等［7］对卵巢癌的研究及Tsai等［8］对胰腺癌的研究均显示，EMMPRIN与卵巢癌及胰腺癌预后的密切相关。同时在对肝癌的研究发现，EMMPRIN在正常肝脏组织中均为阴性表达，而肝癌组织中的阳性率达100%，并且与肝癌的转移和临床分析相关［9］。在其他肿瘤中，EMMPRIN表达与大肠癌、胃癌的病理类型、转移方式相关，在未分化癌中显著高表达，伴血行和淋巴转移者亦呈高表达。EMMPRIN表达与非小细胞肺癌的淋巴结转移和病理分期明显相关。另外，在霍奇金淋巴瘤、膀胱癌、口腔癌等恶性肿瘤中都发现EMMPRIN的表达明显增强。大量的临床和病理研究表明，EMMPRIN在恶性肿瘤的生长、浸润、转移和诱导肿瘤组织的恶性转化等方面起重要作用，并与恶性肿瘤的病理类型和预后密切相关，可以作为判断肿瘤预后的重要指标［10-11］。

在本实验中，本研究构建包含EMMPRIN基因编码框的真核表达载体pCMV-HA2-EMMPRIN，通过质脂体转染CT26细胞，经G418筛选，建立稳定表达EMMPRIN基因的CT26细胞株。

Marieb等［12］转染增加EMMPRIN在低侵袭性的乳腺癌细胞系MDA-MB-436细胞的表达，可以促进该乳腺癌细胞的非锚地依赖性生长（anchorage-independent growth）和透明质酸的形成，同时增加肿瘤细胞的侵袭能力。

目前，EMMPRIN在肿瘤侵袭、转移中的作用机制还不明确，研究表明可能与以下机制有关。体外实验发现肿瘤细胞来源的EMMPRIN通过激活磷脂酶A2、5-脂氧合酶和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase, MAPK）p38激酶信号通路刺激人成纤维细胞和内皮细胞分泌产生MMPs［13-14］；在EMMPRIN刺激多种MMPs生成的同时，对于MMPs组织抑制剂（tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMP）TIMP-1和TIMP-2却无作用［15］，导致使MMPs/TIMPs比值增加。EMMPRIN通过促进MMPs的生成使其含量的增加，从而使MMPs/TIMPs的比值上升，导致肿瘤组织中细胞外基质生成与降解的平衡被打破，使细胞外基质降解增加，从而促进肿瘤的侵袭。本研究通过体外侵袭实验、迁移实验、粘附实验发现EMMPRIN基因可明显促进小鼠结肠癌细胞CT26的侵袭与迁移，并抑制其粘附，提示EMMPRIN基因对CT26细胞转移潜能的具有增强作用。

除上述经典作用机制外，Tang等［16］通过共培养EMMPRIN表达阳性的肿瘤细胞和纤维母细胞，在模拟肿瘤-基质相互作用的模型中发现，EMMPRIN通过刺激MMPs的产生促使肿瘤局部微环境中MMPs活性升高，导致细胞膜表面的膜相联的EMMPRIN蛋白裂解增加释放出可溶性的EMMPRIN蛋白。这些可溶性的EMMPRIN蛋白又通过旁分泌的途径进一步促进临近肿瘤的成纤维细胞产生MMPs和EMMPRIN，形成正反馈的调节机制，促进肿瘤的生长、转移和血管形成。Sidhu等［17］研究亦发现，肿瘤细胞周围的具有功能活性的EMMPRIN蛋白主要是肿瘤细胞通过微泡释放作用产生的。含有EMMPRIN蛋白的微泡由肿瘤细胞释放后，迅速裂解为具有功能活性的EMMPRIN蛋白，刺激肿瘤周围的成纤维细胞产生MMPs促进肿瘤的生长和转移。

［1］ Ellis SM, Nabeshima K, Biswas C. Monoclonal antibody preparation and purification of a tumor cell collagenasestimulatory factor［J］. Cancer Res, 1989, 49(12): 3385-3391.

［2］ Biswas C, Zhang Y, DeCastro R, et al. The human tumor cellderived collagenase stimulatory factor (renamed EMMPRIN)is a member of the immunologlobulin super family［J］.Cancer Res, 1995, 55(2): 434-439.

［3］ Gabison EE, Hoang-Xuan T, Mauviel A, et al. EMMPRIN/CD147, an MMP modulator in cancer, development and tissue repair［J］. Biochimie, 2005, 87(3-4): 361-368.

［4］ Sun J, Hemler ME. Regulation of MMP-1 and MMP-2 production through CD147/extracellular matix metalloproteinase inducer interactions［J］. Cancer Res,2001, 61(5): 2276-2281.

［5］ Muramatsu T, Miyauchi T. Basigin (CD147): a multifunctional transmembrane protein involved in reproduction，neural function, inflammation and tumor invasion［J］. Histol Histopathol, 2003, 18(3): 981-987.

［6］ Chen X, Lin J, Kanekura T, et al. A small interfering CD147-targeting RNA inhibited the proliferation, invasiveness, and metastatic activity of malignant melanoma［J］. Cancer Res,2006, 66(23): 11323-11330.

［7］ Davidson B, Givant-Horwitz V, Lazarovici P, et al. Matrix metalloproteinases (MMP), EMMPRIN (extracellular matrix metalloproteinase inducer) and mitogen-activated protein kinases (MAPK): co-expression in metastatic serous ovarian carcinoma［J］. Clin Exp Metastasis, 2003, 20(7): 621-631.

［8］ Tsai WC, Chao YC, Sheu LF, et al. EMMPRIN and fascin overexpression associated with clinicopathologic parameters of pancreatobiliary adenocarcinoma in Chinese people［J］.APMIS, 2007, 115(8): 929-938.

［9］ Tsai WC, Chao YC, Nieh S, et al. Increasing EMMPRIN and matriptase expression in hepatocellular carcinoma: tissue microarray analysis of immunohistochemical scores with clinicopathological parameters［J］. Histopathology, 2006,49(4): 388-395.

［10］ Du ZM, Hu CF, Shao Q, et al. Upregulation of caveolin-1 and CD147 expression in nasopharyngeal carcinoma enhanced tumor cell migration and correlated with poor prognosis of the patients［J］. Int J Cancer, 2009, 125(8): 1832-1841.

［11］ Liang YX, He HC, Han ZD, et al. CD147 and VEGF expression in advanced renal cell carcinoma and their prognostic value［J］. Cancer Invest, 2009, 27(7): 788-93.

［12］ Marieb EA, Zoltan-Jones A, Li R. EMMPRIN promotes anchorage-independent growth in human mammary carcinoma cells by stimulating hyaluronan production［J］. Cancer Res,2004, 64(4): 1229-1232.

［13］ Lim M, Martinez T, Jablons D, et al. Tumor-derived EMMPRIN (extracellular matrix metalloproteinase inducer)stimulates collagenase transcription through MAPK p38［J］.FEBS Lett, 1998, 411(1): 88-92.

［14］ Taylo PM, Woodfield RJ, Hodgkin MN, et al. Breast cancer cell-derived EMMPRIN stimulates fibroblast MMP2 release through a phospholipase A(2) and5-lipoxygenase catalyzed pathway［J］. Oncogene, 2002, 21(37): 5765-5772.

［15］ Dalberg K, Eriksson E, Enberg U, et al. Gelatinase A,membrane type 1 matrix metalloproteinase, and extracellular matrix metalloproteinase inducer mRNA expression:correlation with invasive growth of breast cancer［J］. World J Surg, 2000, 24(3): 334-340.

［16］ Tang Y, Kesavan P, Marian T, et al. Tumor-stroma interaction: positive feedback regulation of extracellular matrix metalloproteinase inducer (EMMPRIN) expression and matrix metalloproteinase-dependent generation of soluble EMMPRIN［J］. Mol Cancer Res, 2004, 2(2): 73-80.

［17］ Sidhu SS, Mengistab AT, Tauscher AN, et al. The microvesicle as a vehicle for EMMPRIN in tumor-stromal interactions［J］. Oncogene, 2004, 23(4): 956-963.