中华眼镜蛇毒结合免疫抑制剂控制异种移植排斥反应

戚峰，朱理玮，何向辉，邱宇杰，王鹏志

中华眼镜蛇毒结合免疫抑制剂控制异种移植排斥反应

戚峰，朱理玮，何向辉，邱宇杰，王鹏志

目的：探讨协调性和非协调性异种移植免疫排斥不同机理，寻找中华眼镜蛇毒结合免疫抑制药物的最佳治疗方案。方法：采用改良的Heron颈部套袖法分别建立小鼠对大鼠，豚鼠对大鼠异种异位心脏移植模型，受体大鼠各分为4组：1组仅行异种移植不给药；2组联合应用中华眼镜蛇蛇毒因子、环磷酰胺、FK506；3组将2组中华眼镜蛇毒剂量加倍；4组在2组用药组合基础上再加用前列腺素E1。结果：给药组移植供心存活时间明显延长，尤其在小鼠对大鼠模型给予PGE1后（小鼠4组6.92 d）及豚鼠对大鼠模型蛇毒因子剂量加倍后（豚鼠3组27.33 h）。两类模型给药后CH50，异种抗体IgM明显降低，并逐渐出现急性血管排斥反应改变。结论：异种移植后的超急性排斥反应和急性血管排斥反应存在着密切的相互关联，是统一的排斥过程中具有不同特点的两个阶段。中华眼镜蛇毒联合多种免疫抑制药物可控制异种排斥，尤其对非协调性异种移植有更大的作用。

异种移植；心脏；超急性排斥；急性血管排斥；中华眼镜蛇蛇毒因子

为探讨协调性和非协调性异种移植免疫排斥不同机理，以及寻找适宜的药物组合治疗方案，我们分别建立小鼠心脏移植到大鼠的协调性异种心脏移植模型和豚鼠心脏移植到大鼠的非协调性异种心脏移植模型，并联合应用中华眼镜蛇蛇毒（chinese cobra venom,CCV）、环磷酰胺（CTX）、FK506以及前列腺素E1（PGE1），控制异种移植后超急性和急性血管排斥反应，为异种移植的免疫排斥研究和临床应用提供借鉴。

1 材料

1.1 药品中华眼睛蛇蛇毒由广州蛇毒研究所提供，为冻干粉剂，用双蒸水稀释，配成蛇毒溶液。环磷酰胺是江苏恒瑞医药股份有限公司产品，批号0008202。FK506（商品名普乐可复，Prograf）是爱尔兰Fujisawa公司产品，批号5A3043G。前列腺素E1是哈尔滨三联药业有限公司产品，批号20000601。1.2动物供体动物分别为雄性昆明小鼠，体重25～35 g；雄性豚鼠，体重150～200 g；受体为雄性Wistar大鼠，体重为200～250 g。均由天津市药物研究所动物中心提供。

1.3 器材包括德国蔡司双人双目显微镜，显微手术器械，美国B.D.公司FACSCalibur型流式细胞仪等。

2 方法

2.1 异种异位心脏移植模型的建立根据Heron颈部套袖法的手术模式加以改进，建立小鼠对大鼠异种异位心脏移植模型[1]。供、受体均以4%水合氯醛按7.5 mg/kg腹腔内注射麻醉，分离受体大鼠右侧颈外静脉和颈总动脉，离断后近心端分别置血管套管，以微血管夹夹闭血管。供体小鼠开胸，经下腔静脉注入肝素盐水（50 u/mL）0.5 mL，使全身血液肝素化。自下腔静脉插管注入4℃含有25 u/mL肝素的乳酸钠林格液，灌注心脏。仔细分离、剪断供心主动脉及肺动脉，其余血管集束结扎后剪断，摘取供心。将供心肺动脉与受体大鼠右颈外静脉套管连接，主动脉与右颈总动脉套管连接。松开微血管夹，可见供心恢复血运，并出现自主节律性搏动。同法建立豚鼠对大鼠异种异位心脏移植模型，将豚鼠供心左肺动脉与受体大鼠右颈外静脉套管连接，供心无名动脉与右颈总动脉套管连接。

2.2 术后观察术后可在大鼠颈部很容易的看到供心的搏动，对于小鼠供心每12 h观察1次跳动情况；对于豚鼠供心，受体大鼠如术前未给予免疫抑制药物，因其将在短时间内排斥，可直视下观察供心排斥情况，给药后，需随时观察。从供心复跳至完全停止跳动的时间作为供心存活时间。

2.3 实验分组和给药方法对于两类模型，均将受体大鼠分为：1组为对照组；2组为CCV、CTX、FK506组；3组为CCV(加倍剂量)、CTX、FK506组；4组为CCV、CTX、FK506、PGE1组。每组6只大鼠。各组给药方法见表1。

表1 异种心脏移植模型各实验组围手术期免疫抑制药物给药方案

2.4 补体总活性测定小鼠→大鼠模型每组于术后1 d，豚鼠→大鼠模型每组于术后5 min，及排斥发生时，经左颈外静脉取血0.5 mL，收集血清测定补体总溶血活性（CH50）。

2.5 受体大鼠外周血异种抗体IgM检测小鼠→大鼠模型每组于术后1 d，豚鼠→大鼠模型每组于术后5 min，及排斥发生时，获得各组受体大鼠血清。以血清中抗小鼠或抗豚鼠异种抗体为第一抗体，分别与正常小鼠或豚鼠心脏单细胞悬液混合，加入FITC标记小鼠抗大鼠IgM抗体各100 μL作为第二抗体，经流式细胞仪，分别检测受体大鼠血清抗小鼠及抗豚鼠异种抗体IgM浓度。

2.7 病理检测排斥发生后，摘取小鼠和豚鼠移植供心送HE病理检测。并观察移植物中浸润细胞种类，分别记数每张切片在400倍高倍视野下100目网格内多形核细胞和单核细胞数量，计算平均值进行统计分析。

2.8 实验数据统计方法应用SPSS 10.0统计软件包处理。均值±标准差表示为(±s)。多个计量资料间比较采用F检验，计量资料两两比较采用q检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 小鼠对大鼠及豚鼠对大鼠异种移植后各组供心存活时间比较对于小鼠对大鼠模型，4组在加用PGE1后，供心存活时间较2、3组进一步延长（P＜0.05），但3组CCV剂量加倍后，与2组比较效果不显著（P＞0.05）。对于豚鼠对大鼠模型，各组间均存在显著性差异（P＜0.05）。见表2。

表2 小鼠对大鼠及豚鼠对大鼠异种心脏移植术后各组供心存活时间±s)

表2 小鼠对大鼠及豚鼠对大鼠异种心脏移植术后各组供心存活时间±s)

注：与对照组比较，*P＜0.05；与CCV、CTX、FK506组比较，#P＜0.05

组别对照组CCV、CTX、FK506组CCV（加倍剂量）、CTX、FK506组CCV、CTX、FK506组、PGE1组豚鼠供心平均存活时间（h) 0.24±0.06 10.33±6.77*27.33±8.50*#18.67±4.08*#n6 6 6 6小鼠供心平均存活时间（d) 2.25±0.52 4.25±1.25*3.75±0.65 6.92±2.46*#

3.2 受体大鼠血清补体总溶血活性（CH50）测定

用药组（2、3、4组）给予CCV后，在移植早期（术后1 d或5 min），受体大鼠血清CH50明显降低（P＜ 0.05），排斥发生时，小鼠对大鼠模型CH50已恢复正常（P＞0.05），而豚鼠对大鼠模型，CH50仍显著低于1组对照组（P＜0.05）。见表3。

表3 术后受体大鼠血清总补体活性（CH50）改变±s)

表3 术后受体大鼠血清总补体活性（CH50）改变±s)

注：与对照组比较，*P＜0.05；与术后早期（第1 d或5 min）比较，#P＜0.05

组别对照组CCV、CTX、FK506组CCV（加倍剂量）CTX、FK506组CCV、CTX、FK506组、PGE1组小鼠对大鼠模型术后第1 d 30.07±4.99 3.76±2.14*1.23±1.55*14.38±2.19*排斥时33.34±3.23 34.55±3.01#29.34±7.76#35.12±1.19#豚鼠对大鼠模型术后5 min 33.71±4.24 2.55±0.96*1.75±0.83*2.26±1.42*排斥时31.50±8.80 3.57±3.72*2.45±2.16*4.78±1.86*#

3.3 受体大鼠外周血异种抗体IgM检测在小鼠对大鼠模型中，发生排斥时对照组抗小鼠IgM与术后1 d比较存在显著性差异（P＜0.05），而用药组（2、3、4组）术后1 d抗小鼠IgM明显降低（P＜0.05），此后缓慢回升，至排斥发生时，仍低于对照组（P＜ 0.05）。在豚鼠对大鼠模型中，对照组排斥在短时间内发生，出现抗豚鼠IgM明显降低（P＜0.05），而用药组（2、3、4组）术后5 min可检测到抗豚鼠IgM明显降低（P＜0.05），至排斥发生时又明显回升（P＜0.05），但仍显著低于对照组（P＜0.05）。见表4。

表4 术后受体大鼠血清异种抗体IgM改变±s)

表4 术后受体大鼠血清异种抗体IgM改变±s)

注：与对照组比较，*P＜0.05；与术后早期（第1 d或5 min）比较，#P＜0.05

组别对照组CCV、CTX、FK506组CCV（加倍剂量）CTX、FK506组CCV、CTX、FK506组、PGE1组抗小鼠异种抗体IgM术后第1 d 10.99±5.38 5.36±0.82*6.36±0.73*6.67±2.38*排斥时43.56±23.79#18.16±6.97*#15.36±2.75*#39.29±27.85#抗豚鼠异种抗体IgM术后5 min 88.29±7.49 14.72±4.45*12.16±5.88*16.86±9.37*排斥时70.64±11.91#45.22±26.08*#58.54±24.46*#44.71±18.16*#

3.5 病理检测结果排斥发生时，HE染色切片光镜下显示，对照组小鼠心肌间质明显充血、水肿，毛细血管内血栓形成，局部可见梗死区域，大量多形核细胞和单核细胞浸润；给药组随存活时间延长，可见心肌梗死区域扩大，纤维组织增生，单核细胞浸润增多。对于豚鼠供心，对照组心肌间质可见明显充血、水肿，大量红细胞渗出，甚至将心肌纤维分割。毛细血管内淤血、血栓形成。梗死区少见，给药后随存活时间延长，可见多形核细胞和单核细胞浸润。表6显示，无论小鼠或豚鼠供心，给药后，随供心存活时间延长，多形核细胞浸润明显减少（P＜0.05），而单核细胞浸润明显增加（P＜0.05）。

表5 排斥发生时受体大鼠外周血T淋巴细胞改变±s)

表5 排斥发生时受体大鼠外周血T淋巴细胞改变±s)

注：与对照组比较，*P＜0.05

组别对照组CCV、CTX、FK506组CCV(加倍剂量)、CTX、FK506组CCV、CTX、FK506、PGE1组小鼠对大鼠模型CD4+T细胞0.86±0.09 0.65±0.19*0.61±0.24*0.73±0.09*CD8+T细胞0.19±0.10 0.41±0.16*0.43±0.19*0.45±0.25*豚鼠对大鼠模型CD4+T细胞0.79±0.03 0.76±0.05 0.56±0.13*0.69±0.10*CD8+T细胞0.17±0.03 0.23±0.06 0.44±0.05*0.32±0.06*

表6 小鼠及豚鼠移植供心排斥时多形核细胞及单核细胞浸润程度±s)

表6 小鼠及豚鼠移植供心排斥时多形核细胞及单核细胞浸润程度±s)

注：与对照组比较，*P＜0.05

组别对照组CCV、CTX、FK506组CCV(加倍剂量)、CTX、K506组CCV、CTX、FK506、PGE1组小鼠供心多形核细胞12.50±4.61 4.85±5.41*4.93±5.22*4.25±3.06*单核细胞12.27±2.29 8.75±5.15 8.36±4.38 55.55±21.44*豚鼠供心多形核细胞3.28±3.33 2.98±2.10 1.12±0.76*1.50±0.58*单核细胞4.80±1.56 8.57±2.76*12.31±3.19*9.35±1.47*

4 讨论

异种移植多沿用Calne在1970年提出的分类方法[2]，即根据超急性排斥反应（hyperacute rejection，HAR）发生的时间不同，分为移植后迅速发生排斥反应的非协调性异种移植，如豚鼠对大鼠的移植，以及将在移植后2～3 d内发生免疫排斥反应的协调性异种移植，如小鼠对大鼠的移植。本实验豚鼠对大鼠异种心脏移植模型，对照组在不给药的情况下，豚鼠供心的平均存活时间为0.24 h，而在小鼠对大鼠模型中，对照组小鼠供心平均存活时间为2.25 d，但豚鼠及小鼠供心均显示出典型的超急性排斥病理改变。

异种移植虽然从理论上讲具有广阔的应用前景，但是其复杂的免疫排斥反应又制约了它的发展[3]。目前的研究认为，异种移植的HAR主要是由体液免疫介导的免疫反应。由于在受体动物血清中预先存在着的“天然抗体IgM”，可与移植物血管内皮细胞表面的异种α1,3-Gal抗原结合，激活受者的补体系统，攻击移植物血管内皮细胞，从而引发HAR[4]。因此，异种抗体、补体、移植物血管内皮细胞被称为异种移植的三大免疫学屏障。而且HAR被克服后，还会出现更为复杂的急性血管排斥反应（acute vascular rejection,AVR），其机理至今存在着争论[5-6]。

本实验发现，在小鼠供心的排斥过程中，异种抗小鼠IgM抗体处于一个显著上升的状态，且给药组（2、3、4组）受体大鼠血清异种抗小鼠IgM明显降低，移植物存活时间延长。而在豚鼠对大鼠模型中，不给药的情况下对照组由于供心在平均0.24 h内被排斥，异种抗豚鼠抗体出现短暂的明显下降，给药后，豚鼠供心存活时间延长，其异种抗豚鼠IgM抗体变化趋势与小鼠对大鼠模型一致。说明异种抗体IgM在异种HAR中起着重要的作用，应用环磷酰胺类药物抑制异种抗体产生，可以减缓异种HAR的发生。实验数据同时显示，受体大鼠正常状态下血清中抗小鼠异种抗体IgM的水平较低（10.99±5.38），而却含有较高滴度的抗豚鼠异种抗体IgM（88.29± 7.49），说明亲缘关系较远的种属之间可能存在较高滴度的异种抗体IgM，而HAR的发生强度、速度与异种抗体IgM的滴度间可能存在一定的相关性。

补体在异种移植后发生的HAR中起重要的作用。已有研究发现，非协调性异种移植后，受体血清补体含量明显下降，在移植物细胞表面可观察到各类补体成分的沉着，应用眼睛蛇毒因子或其他补体抑制剂可延缓HAR的发生，而中华眼镜蛇毒因子是我国特有的蛇毒提取药物，已有文献报道其消耗补体作用优于国外产品[7-8]。本实验数据显示，在小鼠对大鼠的协调性异种移植中，给予补体抑制剂CCV可以明显降低补体水平，延长移植物存活时间，而且当供心停跳时补体均恢复至原有的高水平状态。而在豚鼠对大鼠模型中，供心停跳时补体水平虽有回升，但仍然较低，尤其3组在应用了加倍剂量的CCV后，使补体水平进一步降低，供心存活时间得到进一步延长（27.33 h），小鼠对大鼠模型的3组中却并无此改变。说明补体参与了异种移植术后HAR的过程，但协调性异种移植排斥可能需高补体活性参与作用，而非协调性异种移植中仅需低活性的补体即可将供心排斥。

当异种移植的HAR得到控制，供心存活时间延长，即进入AVR阶段。本实验在两类模型的给药组中均出现AVR的改变。其特征为移植物血管内皮细胞严重的损伤及弥漫性血管内凝血、单核细胞浸润，病理改变与同种异体移植的急性血管排斥反应非常相似[9-10]。本实验数据显示，在小鼠移植供心中，对照组在发生HAR的移植物中即可见多形核及单核细胞浸润，此时受体大鼠外周血CD4+T细胞比例明显增高，用药后随供心存活时间延长单核细胞浸润进一步增多，而多形核细胞呈逐渐减少的趋势，外周血CD4+T细胞接近正常水平，而CD8+T细胞明显增殖。表明在AVR中单核吞噬细胞系统成为免疫排斥的重要组成部分。而在豚鼠供心中细胞浸润现象明显少于小鼠供心，但随时间延长，外周血CD8+T细胞增殖增高，移植物单核细胞浸润也呈逐渐增多趋势。PGE1可抑制血液凝固、稳定血管内皮细胞、并抑制T细胞毒效应，加入PGE1使小鼠供心存活时间进一步延长，说明其对AVR的抑制作用。上述数据一方面说明非协调性异种移植的HAR更加急剧，另一方面也说明AVR与HAR并不是截然分开的两个过程，它们没有绝对的时间限制。目前关于同种或异种移植AVR的机制仍然存在争论，但越来越多的证据表明异种抗体与移植物血管内皮细胞的结合，也许还包括补体的作用，最终导致内皮细胞的激活。激活的内皮细胞通透性增加、释放细胞因子促进血液凝固和炎症的发展，使移植物出现血栓形成、缺血等病理改变。此外，NK细胞和其它炎症细胞、以及参与凝血系统的分子的不匹配等因素，也参与了AVR的发生发展过程[11]。

本实验表明，非协调性异种移植后将发生更为严重的HAR，其中补体活性、异种抗体IgM滴度都可能起着重要的作用。而且异种移植后的HAR和 AVR并不是截然分开的两个过程，存在着密切的相互关联，是整个排斥过程中具有不同特点的两个阶段。针对异种排斥的特点，联合应用多种免疫抑制药物，尤其是加用中华眼镜蛇毒因子，才可能取得较好的治疗效果。CCV、CTX、FK506、PGE1组合对协调性异种移植较为适用，对非协调性异种移植，应进一步加大CCV用量，增加对补体的抑制。

[1]Heron I.A technique for accessory cervical heart transplantation in rabbits and rats[J].Acta Pathol Microbiol Scand,1971,79(4): 366.

[2]Calne RY.Organ transplantation between widely disparate species [J].Transplant Proc,1970,2(1):550.

[3]Zhong R.Gal knockout and beyond[J].Am J Transplant,2007,7 (1):5.

[4]Baumann BC,Stussi G,Huggel K,et al.Reactivity of human natu⁃ral antibodies to endothelial cells from Galalpha(1,3)Gal-deficient pigs[J].Transplantation,2007,83(2):193.

[5]Hosiawa KA,Wang H,DeVries ME,et al.CD80∕CD86 costimula⁃tion regulates acute vascular rejection[J].J Immunol,2005,175(9): 6197.

[6]Wang H,Hosiawa KA,Garcia B,et al.Treatment with a short course of LF 15-0195 and continuous cyclosporin A attenuates acute xenograft rejection in a rat to mouse cardiac transplantation model[J].Xenotransplantation,2003,10(4):325.

[7]Chen G,Sun QY,Wang XM,et al.Improved suppression of circu⁃lating complement does not block acute vascular rejection of pig-to-rhesus monkey cardiac transplants[J].Xenotransplanta⁃tion,2004,11(2):123.

[8]Li R,Chen G,Guo H,et al.Prolonged cardiac allograft survival in presensitized rats after a high activity Yunnan-cobra venom factor therapy[J].Transplant Proc,2006,38(10):3263.

[9]Ghanekar A,Mendicino M,Liu H,et al.Endothelial Induction of fgl2 Contributes to Thrombosis during Acute Vascular Xenograft Rejection[J].The Journal of Immunology,2004,172(9):5693.

[10]Ginesta MM,Ribas Y,Mollevi DG.,et al.Acute xenograft rejec⁃tion,late xenograft rejection and long term survival xenografts in the hamster-to-rat heart transplantation model:histological charac⁃terisation under low-dose of FK506[J].APMIS,2002,110(10):737.

[11]Parker W,Lin SS,Platt JL.Antigen Expression in Xenotransplan⁃tation:How Low Must It Go?[J].Transplantation,2001,71(2):313.

（收稿：2010-02-20修回：2010-06-10）

（责任编辑刘洪斌田在善）

Research on Function of Integrated Chinese Cobra Venom and Immune Suppressive Drugs on Immune Rejection in Xenotransplantation

Qi Feng,Zhu Liwei,He Xianghui,et al.Department of General Surgery,

Tianjin Medical University General Hospital,Tianjin(300052），China

ObjectiveTo study the immune mechanism of concordant and discordant xenotransplantation and methods of controlling immune rejection by combined Chinese Cobra Venom and other immune suppressive drugs.MethodsThe mouse to rat and the guinea pig to rat heterotopic cardiac xenotransplantation models were established by improved Heron’s cuff technique in neck,which were divided into 4 groups respectively as following:Group 1

xenograft without treatment;Group 2 was treated with CCV,CTX,and FK506;The dose of CCV in Group 3 was doubled;Group 4 was treated with CCV,CTX,FK506,and PGE1.ResultsThe cardiac survival time of Group 2,3,4 increased obviously,especially for Group 4 of mouse to rat model with PGE1 treatment(6.92 days)and for Group3 of guinea pig to rat model with double-dosed CCV(27.33hrs).In both of the models,the levels of CH50 and xeno-IgM decreased after treatment and acute vascular rejection(AVR) gradually happened.ConclusionThe HAR and AVR in xenotransplantation are closely related and inter⁃laced without limit.Chinese Cobra Venom combined with other immune suppressive drugs can be effective in xenotransplantation,especially for discordant xenotransplantation.

xenotransplantation,cardiac,hyperacute rejection(HAR),acute vascular rejection(AVR),Chi⁃nese cobra venom(CCV)

R617;R541

A

1007-6948(2010)04-0448-05

10.3969∕j.issn.1007-6948.2010.04.018

国家自然科学基金资助项目（30500489）

国家自然科学基金资助项目（30940066）

天津医科大学总医院普通外科（天津300052）

戚峰，E-mail：qf@medmail.com.cn