原花青素对人结肠癌细胞SW620增殖和凋亡的影响

何佳声，黄学锋

实验研究

原花青素对人结肠癌细胞SW620增殖和凋亡的影响

何佳声1，黄学锋2

目的：观察葡萄籽提取物原花青素对人结肠癌细胞株SW620细胞增殖和凋亡的影响。方法：SW620细胞与20、40、60、80μg∕mL的原花青素共同孵育24 h～8 d，采用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖抑制率，流式细胞术分析细胞凋亡情况，分光光度法检测Caspase-3酶活性。结果：不同浓度(20～80μg∕mL）的原花青素对SW620细胞的生长有明显的抑制作用，呈现出一定的剂量依赖性；含原花青素20、40、80μg∕mL的观察组细胞凋亡发生率分别为6.9%、18.6%及22.9%，不含药的对照组细胞凋亡发生率为1.3%。SW620细胞与含药（40μg∕mL）或不含药的培养基共同培养48 h或72 h，对照组细胞几乎无法检出Caspase-3酶活性，而给药组细胞活性显著增加。结论：原花青素在体外可呈浓度依赖性抑制人结肠癌细胞株SW620的增殖并通过Caspase-3通路促进其凋亡。

结肠癌；葡萄籽提取物原花青素；增殖；凋亡

原花青素(proanthocyanidins，PC)是由不同数量的儿茶素或表儿茶素缩合而成的一大类酚类化合物，广泛分布于水果、豆类、巧克力等多种食物和水果汁、葡萄酒、啤酒、茶等饮料中[1]。近年来的研究显示，原花青素可抑制乳腺癌、肺癌、胃癌、慢性骨髓白血病等多种肿瘤细胞的生长，诱导多种肿瘤细胞凋亡。据推测，其抗癌机制可能与其强大的抗氧化和清除自由基能力、抗炎作用、调节信号分子如环氧酶-2、核因子-κB及阻滞细胞周期、抑制肿瘤血管生成等有关。原花青素在结肠癌中的相关作用未见相关报道，我们将不同浓度葡萄籽原花青素与人结肠癌细胞SW620共同培养，观察其对SW620细胞增殖和凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料人结肠癌SW620细胞株购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。RPMI 1640培养基(Gibco，美国)；胎牛血清(杭州四季青公司)；葡萄籽原花青素(南京青泽医药科技有限公司，纯度≥95%，以无血清RPMI 1640培养基配成10 mg/mL的母液，0.22μm滤膜过滤除菌，-20℃保存)；MTT (Amresco，美国)；DMSO(Sigma，美国)；胰蛋白酶（Amresco，美国)；其他常规试剂均为国产分析纯。倒置显微镜(Olympus，日本)；全自动酶标仪(ELX800 G型，美国)；流式细胞仪(BD FACSCalibur，美国)。Caspase-3活性检测试剂盒（上海碧云天生物技术研究所）。

1.2 细胞培养用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养液，置于含5%CO2培养箱中，在37℃、95%湿度条件下培养人结肠癌细胞株SW620。0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化、传代细胞。

1.3 细胞生长曲线取对数生长期的SW620细胞，按每孔1×104个细胞接种于96孔板，每孔100μL，贴壁24 h后换液，随后分为对照组和4个不同浓度的原花青素试验组，共5组。其中对照组用含终浓度为0.1%DMSO完全培养液培养，试验组则分别以含20、40、60、80μg/mL原花青素（0.1%DMSO）的完全培养液培养。每组均设4个复孔，于37℃、5% CO2培养箱中培养。噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞生长活力。分别于加药后2～8 d(每48 h换液1次，换液时保证各组完全培养液中的原花青素浓度不变)每孔加入50μL MTT(2 mg/mL)继续培养4 h。4 h后弃去孔内液体，每孔加入150μL DMSO，振荡10 min后，用酶联免疫检测仪于570 nm波长处测定每孔的OD值，求出每一组的平均OD值。

1.4 细胞周期分析将上述细胞处理后置于37℃、5%CO2孵箱中培养24 h；每组设3个复选孔。用胰酶消化细胞，并收集原培养上清置于5 mL离心管中，2 000 g离心10 min；去上清液后，用PBS缓冲液洗细胞两遍；去上清液后每管加入预冷70%乙醇，4℃冰箱内过夜保存；再用PBS缓冲液洗细胞两遍，去上清液，每管加入碘化丙啶（PI）至终浓度为50 μg/mL，混匀，4℃避光PI荧光染色；在流式细胞仪上进行细胞周期分析。FACScan分析DNA亚二倍体的形成及细胞周期的变化。

1.5Caspase-3酶活性测定将上述处理后的细胞以600 g 4℃离心5 min，收集细胞，小心吸除上清，PBS洗涤1次。吸尽上清后，按每200万细胞加入100μL裂解液的比例加入裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解15 min，4℃16 000～20 000 g离心10～15 min，把上清转移到冰浴预冷的离心管中，按试剂盒说明书操作步骤测定caspase-3酶活性。

1.6 统计学方法全部统计分析均采用SPSS 12.0软件进行，实验数据均以±s)表示，组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 对SW620细胞生长曲线的影响含原花青素20～80μg/mL的完全培养基，在培养2～8 d期间，与不含药物的对照组相比，可呈剂量依赖性地抑制SW620细胞生长（见图1）。在培养48 h后，观察到其IC50（半数抑制浓度）为45.07μg/mL。

2.2 对SW620细胞凋亡的影响SW620细胞与含原花青素20～80 μg/mL的完全培养基或不含药的完全培养基共同培养48 h后，收集全部培养细胞经流式细胞术检测，不含药的对照组细胞凋亡发生率为1.3%，含原花青素20、40、80 μg/mL的观察组细胞凋亡发生率分别为6.9%、18.6%及22.9%，与对照组相比有统计学差异，且呈现一定的剂量依赖性，见图2、图3。

图2 不同浓度原花青素对SW620细胞凋亡的影响

注：与对照组比较，*P＜0.05,**P＜0.01

图3 不同浓度原花青素对SW620细胞凋亡的影响

2.3 对Caspase-3酶活性的影响SW620细胞与含药（40 μg/mL）或不含药的培养基共同培养48 h或72 h，对照组细胞几乎无法检出Caspase-3酶活性（0.13±0.05）;（0.15±0.04）nmol pNA/mg蛋白，而给药组细胞活性（5.09±1.23）、（21.31±3.97）nmol pNA/mg蛋白显著增加（见图4）。

图4 原花青素对SW620细胞Caspase-3酶活性的影响

3 讨论

研究表明，人类多种恶性肿瘤的发生发展是其细胞凋亡过程严重受阻，从而使肿瘤细胞在数量上无限恶性增生的结果，这种增殖与死亡的平衡失调被认为是由细胞凋亡的调节紊乱所引起。细胞凋亡在控制细胞增殖、肿瘤发生和生长中起着关键作用。诱导细胞凋亡也成为肿瘤治疗的新靶点。临床上常用的化疗药物多具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用，但常有较大的毒副作用，长期使用也易产生耐药性。因此，从天然动植物中寻找抗癌新药越来越受到人们的重视。原花青素是存在于多种植物中具有强大抗氧化能力的一大类酚类化合物，对皮肤癌、口腔癌、乳腺癌、肝癌、肺癌等都有一定的防治作用。在本研究中，我们发现原花青素可明显抑制结肠癌SW620细胞的生长，该药在45.07 μg/mL可使半数细胞生长受抑制，在80 μg/mL可完全抑制SW620细胞的生长。原花青素抑制SW620细胞的生长可能与其阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡有关。在对细胞Caspase-3酶活性的检测实验中证实了原花青素可通过诱导细胞凋亡从而抑制肿瘤细胞的生长。

原花青素可能通过多种途径发挥抗肿瘤作用。自由基导致DNA损伤且抑制损伤后的修复，是自由基诱导细胞癌变的主要原因。原花青素在体内抗氧化能力是维生素E的50倍，维生素C的20倍。因此，其强大的抗氧化和清除自由基的能力，可能是其抗肿瘤的主要机制之一。肿瘤性疾病与局部炎症反应有关。在原花青素对小鼠紫外线光致癌的保护作用的研究中发现，原花青素能通过IL-12诱导阻止紫外线诱导的免疫系统抑制，发挥抗癌作用[2]。原花青素还可通过对信号分子的调节发挥抗肿瘤作用。原花青素能抑制人表皮癌A431细胞中环氧酶-2的表达，抑制肿瘤细胞的生长[3]。原花青素能降低A431细胞中蛋白激酶B的磷酸化，后者可以在磷脂酰肌醇-3激酶激活后磷酸化并促进癌细胞生长[4]。原花青素能减少小鼠乳腺癌4T1细胞和人表皮癌细胞A431中Bcl-2的表达，同时增加Bax的表达，Bax/Bc1-2的高比率导致caspase的断裂，进而发生凋亡[5]。葡萄籽原花青素能降低细胞周期素依赖激酶-2、4、6及细胞周期素D1、D2和E表达水平，使细胞周期阻滞[6]。此外，从日本木瓜中提取的原花青素是基质金属蛋白酶-2、9的有效抑制剂，抑制肿瘤血管生成和转移[7]。

本研究将原花青素作用于人结肠癌细胞SW620后，发现其能抑制癌细胞的生长，并能诱导其凋亡，这为探寻天然药物在结肠癌治疗方面的研究和应用开拓了新的思路，但该药在防治结肠癌中的详细机制尚需进一步研究。

[1]Santos-Buelga C,Scalbert A.Proanthocyanidins and tannin-like compounds in human nutrition[J].J Food Sci Agric,2000,80:1094.

[2]Sharma SD,Katiyar SK.Dietary grape-seed proanthocyanidin inhi⁃bition of ultraviolet B-induced immune suppression is associated with induction of IL-12[J].Carcinogenesis,2006,27:95.

[3]Meeran SM,Katiyar SK.Grape seed pmanthocyanidins promote apoptosis in human epidermoid carcinoma A43l cells through al⁃ter-ations in Cdk-cyclin cascade and caspase-3 activation vialossof mitochondrial membrane potentia1[J].Exp Dermatol,2007, 16:405.

[4]Meeran SM,Proanthocyanidins inhibit mitogenic and survival-sig⁃nalling in vitro and tumor growthin vivo[J].Front Biosci,2008, 13:887.

[5]Mittal A,Elmets CA,Katiyar SK.Dietary feeding of proanthocyani⁃dins from grape seeds preventsphotocarcinogenesis in SKH-l hairless mice：relationship to decreased fat and lipid peroxidution [J].Carcinogenesis,2003,24:1379.

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（收稿：2009-12-12修回：2010-04-20）

（责任编辑刘洪斌田在善）

Effect of Grape Seed Procyanidin Extract on Proliferation and Apoptosis of Human Colon Cancer Cell Line SW620

He Jiasheng,Huang Xuefeng.The Second Peoples’Hospital,Fuyang City,Zhejiang Province Fuyang(311404),China

ObjectiveTo observe the effects of grape seed procyanidin extract on proliferation and apopto⁃sis of human colon cancer cell line SW620.MethodsSW620 cells and culture media with procyanidin(20, 40,60,80 μg∕mL)were co-incubated for 24 h or 8 days.Cell proliferation rate,cell apoptosis and caspase-3 ac⁃tivity were determined by methyl thiazolyl tetrazolium(MTT)colorimetric assay,flow cytometry analysis and spec⁃trophotometric detection respectively.ResultsThe growth of SW620 cells was significantly inhibited by differ⁃ent concentrations(20-80 μg∕mL)of procyanidin in a dose-dependen manner.Apoptosis rates in the cells of the observer group containing procyanidin(20,40,80 μg∕mL)were 6.9%,18.6%and 22.9%respectively,which was 1.3%in the control group.SW620 cells and culture media with drug(40 μg∕mL)ornot were co-incubated for 48 h or 72 h,caspase-3 activity was hardly determined in the control group cells,while the activity was significant⁃ly increased in the treatment group.ConclusionThe procyanidin can inhibit the proliferation of colon cancer cell line SW620 in vitro in a dose-dependent manner and promote cell apoptosis through caspase-3 pathway.

colon cancer,grape seed extract proanthocyanidins,proliferation,apoptosis

R735.3+5

A

1007-6948(2010)04-0439-04

10.3969∕j.issn.1007-6948.2010.04.015

1.浙江省富阳市第二人民医院外科(富阳311404)

2.浙江大学医学院附属邵逸夫医院肛肠科