高等植物脂氧合酶研究进展

李彩凤，赵丽影，陈业婷，越 鹏，谷 维，王园园，滕祥勇，王楠博

（东北农业大学农学院，哈尔滨 150030）

脂氧合酶（Lipoxygenase,编号 EC1.13.11.12,LOX）俗称脂肪氧化酶、脂肪加氧酶或脂肪氧合酶。分子质量范围一般在90 000～100 000之间，是一种含非血红素铁蛋白的氧合酶，酶蛋白由单肽链组成，属氧化还原酶。它是通过专门催化具有顺、顺-1，4戊二烯结构的不饱和脂肪酸的加氧反应，生成脂肪酸氢过氧化物，而由脂氧合酶启动合成的一系列环状或脂肪族化合物，统称为氧脂，一般将此代谢过程称之谓LOX途径或十八碳酸途径[1]。在植物界中，脂氧合酶底物主要是亚油酸（LA）、亚麻酸（LNA）等，其加氧位置是C9和C13（见图1）[2]。

图1 LOX亚油酸和亚麻酸等主要底物上的加氧碳位Fig.1 Position of oxygen insertion on of linoleic and linolenic acid

近些年来，有关该酶的研究倍受人们关注。许多研究表明，植物LOXs主要位于原生质体、液泡和细胞质中[1]。LOX是植物体内一类重要同工酶，在植物的生长发育、成熟衰老以及抵御机械伤害和病虫侵染等逆境过程起重要的调节作用[3]，同时植物LOX是一个多基因家族，存在着同工酶，所以在同一物种中，在不同的作用条件下可诱导相应基因的表达，因此本文将对脂氧合酶在高等植物中的酶学特性、生理学功能及分子生物学方面的研究进展作一简单概括。

1 脂氧合酶酶学特性

1.1 脂氧合酶活性部位

就目前的研究报道来看，LOX活性部位的结构尚不是很清楚，其活性部位的基团可能含有铁、芳香族氨基酸残基和蛋氨酸残基等，但是目前普遍认为催化中心与铁离子有关，其活化态为高自旋的氧化型三价铁，非活化态为高自旋的还原型二价铁[4]。LOX活性中心结构使它们对底物有特异性的要求，其抑制剂根据其来源可分为人工合成的以及天然提取物，其抑制机理包括与底物竞争酶的活性部位、鳌合作用、还原作用和竞争脂质自由基[5]。例如，大豆LOX-1模型中，以铁离子为中心，并且含有不同数目的内源配体和外源配体[6]。Ohta等分析了稻胚中的脂氧合酶同工酶LOX-3的氨基酸组成，发现它为单一胚，其氨基酸组成与大豆和豌豆的类似，纯酶含0.73 Fe atom·mol-1[7]。

1.2 脂氧合酶催化特性

在催化反应机理上，Tappel等认为，LOX所催化氧化的亚油酸不同于亚油酸自动氧化过程[8]。首先是亚油酸、氧和LOX形成复合体；再在酶的表面形成一个双游离基活化体，即一个氢离子和一个电子从亚油酸上转移至氧分子上；双游离基在酶分子表面结合形成亚油酸过氧化氢；此过氧化氢物与酶分离并脱落下来。而自由基理论认为：首先氢原子从底物上离开，同时铁离子被还原；分子氧与底物自由基反应,形成过氧化自由基，在此过程中有可能伴随O2转变成O2-·自由基，最后过氧自由基被LOX的铁还原，生成氢过氧化合物，而LOX的铁转变为Fe3+，重新转变为活性态[9]。近年来，大豆LOX中质子电子的转移反应证实了LOX反应过程中的氢转移理论[10]，认为催化的氢原子从底物亚油酸转移到铁离子上；质子和电子同时在供体和受体之间转移；从而产生有效的氢隧道效应。因此，从以上几种理论都可以看出LOX催化中心与铁离子有着密切的关系。

在应用上，中国对LOX的研究主要集中在活性、pH、温度或金属离子络合剂等影响酶活的因子及产生醛风味物质等方面，很少见有关催化机理、固定化及深层利用方面的报道[11]。国外在LOX固定化方面做过一些工作[12]，通过SP-HPLC对几种水产动植物中LOX催化亚油酸甲酯氧化形成的氢过氧化物进行了定性、定量分析，这也是较突出的一面[13]。

1.3 脂氧合酶同工酶、最适温度及pH

LOX报道始见于1932年，最初研究发现于大豆植物中[14]，因此也就注定了大豆LOX研究是最清楚的，现知道大豆种子中的LOX具有三种同工酶类型，即LOX-1、LOX-2、LOX-3，在受伤后不久的大豆叶片中也已分离出LOX-7、LOX-8两种同工酶，并发现这两种同功酶在幼叶、花和未成熟的荚中都存在，并具有很高的酶活性[15]。目前大豆的LOX-1、LOX-3、兔网织红血球LOX-1晶体结构，这三种生物的LOX已经被研究清楚[16]。

如今已从水稻成熟种胚中也分离出了三种LOX同工酶，根据层析图谱洗脱顺序的不同，分别定名为水稻LOX-1、LOX-2和LOX-3，其中LOX-1和LOX-2属于第Ⅱ类LOX，即13-LOX，而LOX-3属于第Ⅲ类LOX即9-LOX[17]。在水稻不同品种的种子成熟过程中，LOX活性变化规律不一致。在水稻成熟过程中，种子中LOX-3活性和表达水平都显著高于其他两种同工酶，种子萌发过程中LOX-2活性和表达水平占优势，而LOX-1在种子成熟和萌发过程中无论在活性和表达水平上都显示比较低[18]。常见植物LOX性质如表1所示[19-24]。

表1 几种植物LOX的某些性质Table 1 Characteristics of lipoxygenases of several plant

续 表

2 脂氧合酶生理学功能

2.1 脂氧合酶与衰老

植物衰老是一种受遗传和内外因子影响，且高度有序细胞程序化死亡的过程。对LOX生理功能的研究表明，在植物的衰老、抗病反应以及其生长过程中LOX都有一定的作用。由于LOX的反应产物可进一步生成自由基，以及细胞膜脂中的多聚不饱和脂肪酸链可受LOX催化而导致膜降解，因此，人们自然把LOX与衰老功能相联系。植物LOX的生理功能是为植物激素提供合成前体物，如茉莉酸（JA）及其甲酯和愈创激素[25]，其代谢产物中含有活性氧和氧自由基，对细胞膜具有一定的破坏作用，因而参与植物的衰老和抗病性过敏坏死反应[26-27]。例如，愈创激素和愈创酸在植物组织伤口愈合时发生作用，防御受伤组织中病原菌的入侵。而茉莉酮酸类似于脱落酸（ABA），具有抑制生长的作用，因而被认为是植物衰老的促进剂。在植物组织膜脂过氧化作用启动时，需要脂氧合酶，一旦脂质过氧化反应启动后，LOX便会自我活化，而衰老过程中膜磷脂的逐步降解，则是LOX底物游离脂肪酸的主要来源，LOX过氧化产物可导致组织衰老，其主要机制包括促进合成蛋白质酶类的失活、抑制叶绿体的光化学活性以及加速细胞膜的降解。因此，LOX对植物的衰老起着非常重要的作用，但是，只有当生物体发育到一定阶段或受到环境胁迫时LOX才启动[28]。例如，绿豆子叶衰老过程中线粒体膜对几种氨基酸的透性随衰老进程而下降，表现为离体线粒体膜在脯氨酸、丝氨酸、甘氨酸等渗溶液中的膨胀率从2天龄到5天龄子叶逐渐下降[29]，但是，在整个植物的衰老过程中这几种氨基酸并不都呈下降趋势，其原因有待进一步研究。研究表明，随着果实的成熟和衰老，LOX活性逐渐升高[23]。例如，在苹果果实发育及后熟过程中，其幼果期的LOX均出现较高活性高峰，之后下降，至成熟后果实LOX活性又开始提高[30]。可见，LOX活性表达状况可能是衡量果实贮藏特性的一个重要因素。

2.2 脂氧合酶与外界条件

在植物生长期间，温度、水分、光照、盐浓度、抑制剂等都会影响LOX活性变化，在果实成熟及贮藏期间表现得尤为明显。研究表明，贮藏温度、生长调节物质等变化，都会影响果实组织LOX活性变化，但对于非跃变型果实成熟与衰老过程中LOX活性变化情况报道较少[31]。常温下植物果实软化衰老加快，LOX活性较高，在贮藏前期，低温可显著抑制LOX的活性且在一定程度上延迟了衰老[32]。外施水杨酸处理豌豆叶片可降低其茉莉酸含量，有效抑制LOX活性从而延缓了植物的衰老[33]。

2.3 植物脂氧合酶活性测定

目前脂氧合酶测定的方法有很多种，但是每一种测定方法都有其不同的测定原理、参数及优缺点。结果见表2[34-38]。

表2 几种测定脂氧合酶催化活性方法的比较Table 2 Comparison of determination methods of lipoxygenase catalytic activity

在LOX活性测定的方法上，根据不同试验目的的需求在不断的改进。如今又已开发研制了植物脂氧合酶同功酶快速检测技术，是利用脂氧合酶偶联氧化还原指示剂产生显色反应的原理，建立测定LOX同功酶活性的方法。例如，通过此技术对大豆种质资源和后代材料进行筛选，得到大豆脂氧合酶同功酶部分缺失和全缺失材料，以及应用于无豆腥味大豆品种进行辅助育种具有极其重要的意义[39]。通过染色和显色法快速测定番茄中LOX酶活变化，研究其与果实成熟度和挥发性香气成分间的关系等[40]。

3 脂氧合酶的分子生物学

3.1 脂氧合酶基因克隆

如今研究者已经利用分子克隆技术首次在1987年确定了大豆LOX-1的完整氨基酸序列，并且在研究脂氧合酶诱导防御对于大豆品种的袭击中表明，消除了LOX同工酶和Kunitz型蛋白酶抑制剂的大豆种子，克服了不良豆腥味大豆产品产生的相关问题[41]。人们已经从拟南芥、番茄、马铃薯、烟草、猕猴桃等植物中分别克隆到了多个基因家族成员。根据GenBank公布的氨基酸序列，构建了1个植物LOX基因系统进化树，得知该系统树由3个分支组成[42]。而利用猕猴桃EST库及相关生物信息学手段，从果肉组织克隆了LOX基因家族成员6个，命名为 AdLOX1～6。AdLOX1、AdLOX2、AdLOX3和AdLOX4为全长cDNA，AdLOX5和AdLOX6为cDNA片段[43]。到目前为止，至少有40多种植物LOX的基因被分离鉴定，这为研究它们之间的系统进化关系，阐明基因序列、结构、位置特异性和活性之间的关系提供了可能。

3.2 脂氧合酶基因表达

脂氧合酶基因家族在植物界广泛存，是一个多基因的家族，具有9-LOX和13-LOX两种类型，存在着不同数量的同工酶，同一物种的不同发育阶段、以及不同的胁迫作用，可诱导相应基因的表达。研究表明，植物LOX基因的表达贯穿于植物生活史的整个过程，在植物生长发育的各个阶段，包括种子的萌发、块茎的形成、结节的发育、果实的成熟以及植物体的衰老，都存在着相应LOX基因表达[44]。例如，烟草Phytopathora parasitica可以诱导LOX在烟草叶片表达并产生过敏性细胞死亡[45]； Hildebran等观察到大豆叶片受伤后，LOX活性和基因表达都因叶片受伤而增加[46]；受发育信号调节，一些特异的LOX基因在大麦、黄瓜和大豆种子萌发的早期阶段被诱导[47]。果蔬类已从番茄中克隆到4种不同的LOX基因，即从果实中得到的tomLOXA和tomLOXB，以及从叶片中得到的tomLOXC和tomLOXD[3]，并且在不同的组织或同一组织的不同发育阶段有不同的表达模式。不同植物的LOX基因表达已经逐渐被研究清楚，说明研究LOX基因技术也在不断的发展成熟中。

3.3 脂氧合酶基因与逆境

研究表明，水稻LOX-3是主要的种胚脂氧合酶同工酶，与非转基因植株相比，反义LOX-3转基因植株对水分胁迫、稻瘟病和白叶枯病都表现敏感，说明水稻种胚LOX-3基因在逆境胁迫反应中发挥一定的作用[48]。许多植物的LOX基因在伤害和病原物诱导下表达。例如，水稻稻瘟病菌可以诱导LOX的表达[49]。此外，国外的研究者在诱导9-LOX耐盐的盐细胞脐橙上，为了试图解决LOX活性的过氧化物的积累作用，分析了细胞中的脐橙，在蛋白的表达条件和压力下对不同盐敏感性进行分析，均在体外和体内揭示了9-LOX活性和一个非常快速减少氢过氧化物的相应羟基衍生物。这表明代谢产物之一在进一步下游还原酶通路可能发挥关键作用，对盐胁迫等逆境起着防御作用[50]。

总之，随着现代分子生物学技术的不断发展，使植物LOX生理功能的研究得以加快，这必将有助于深入探讨植物LOX基因与逆境调控的关系，可为研究植物LOX的作用机制提供新途径。

4 脂氧合酶研究展望

对脂氧合酶的研究大约已有70多年的历史，无论是在LOX生化特性还是在基因的克隆及表达上都有很大的进步。很多的研究者也开始研究LOX对外界不良的环境及生理条件的影响，其目的是为了研究出能够产生抗性的植株。同时研究者也开始利用基因沉默、基因删除等手段进行转基因植物的研究，同时对LOX产物分析的方法也在不断地改进，从而大大地推动了LOX途径及代谢产物生理作用的研究。LOX在工业上应用前景也将非常广阔，可用于染料、涂料、洗涤剂或聚氯乙烯增塑剂等的工业化生产。

我国对脂氧合酶的研究起步较晚，针对其动力学、分子生物学以及抑制机理的研究是今后应重点加强的。许多试验表明，LOX具有氧化生物膜的能力，其作用机制有待深入探讨。由于脂氧合酶对油脂的氧化作用，导致一些食品品质下降，货价期相对缩短，因此，对脂氧合酶的抑制机理及抑制方法的研究也具有重要的意义。

此外，利用现代分子生物学技术手段，从分子水平深入揭示LOX对植物不同器官、组织及细胞衰老的作用机制，进而采用多种方法调控由多条代谢途径组成的植物衰老系统，设计出更好的调控衰老战略方法，并使其应用到经济作物上，这样才能实现最大的理论和现实价值。

[1] Vick B A,Zimmerman D C.Oxidative systems for modification of fatty acids:the lipoxygenase pathway[J].The Biochemistry of Plants,1987(9):53-90.

[2] Esquerre-Tugaye M T,Fournier J,Pouenat M L,et al.Lipoxygenases in plant signalling[M]//Fritig B,Legrand M.Mechanisms of plant defense responses.London:Academic Publishers,1993:202-210.

[3] Heitz T,Bergey D R,Ryan C A.A gene encoding a chloroplast targgeted lipoxygenase in tomato leaves is transiently induced bywounding,systemin，and methyl jasmonate[J].Plant Physiol,1997,114:1085-1093.

[4] Tomchick D R,Phan P,Cymborowski M,et al.Structural and functional characterization of second-coordination sphere mutants of soybean lipoxygenase-1[J].Biochemistry,2001,40:75-91.

[5] 何婷,赵谋明,崔春.脂肪氧合酶的酶学特性及其活性抑制机理的研究进展[J].食品工业科技,2008,29(2):291-294.

[6] Boyington J C,Gaffney B J,Amzel L M.The 3-dimensional structure of an arachidonic-acid 15-lipoxygenase[J].Science,1993,260:1482-1486.

[7] Ohta H,Shirano Y,Tanaka K,et al.cDNA cloning of rice lipoxygenase L-2 and characterization using an active enzyme expressed from the cDNA in Escherichia coli[J].Eur J Biochem,1992,206(2):331-336.

[8] Tappel A C,Boyer P D,Lundberg W O.The reachtion mechanism of soybean lipoxidase[J].J Biol Chem 1952,199:267-281.

[9] Borowski T,Broclawik E.Catalytic reaction mechanism of lipoxygenase:a density functional theory study[J].J Phys Chem B,2003,107:4639-4646.

[10] Schiffer S H.Hydrogen tunneling and p rotein motion in enzyme reactions[J].Acc Chem Res,2006,39:93-100.

[11] 蔡琨,方云,夏咏梅.植物脂肪氧合酶的研究进展[J].现代化工,2003,23(增):23-27.

[12] Battu S,Cook M J,Beneytout J L.Stabilization of potato tuber lipox-ygenase on talc[J].Biochimicaet Biophysica Acta,1994,211:270-276.

[13] 周静峰,何雄.脂氧合酶（LOX）反应产物的液相色谱分析[J].食品研究与开发,2006,27(10):167-169.

[14] 张露,王晖,安传世,等.芦笋保鲜技术研究及脂氧合酶抑制剂的保鲜应用初探[J].食品科学,2007,28(3):338-340.

[15] Saravitz D M,Siedow J N.The differential expression of wound inducible lipoxygenase genes in soybean leaves[J].Plant Physiol,1996,110:287-299.

[16] 李靖,马长乐.植物脂氧合酶研究进展[J].生物学杂志,2007,2(6):5-8.

[17] Ida S,Masaki Y,Morita Y.The isolation of multiple forms and product specificity of rice lipoxygenase[J].Agr Biol Chem,1983,47(3):637-641.

[18] 汪仁,沈文飚,江玲,等.水稻种子成熟和萌发过程中脂氧合酶同工酶活性及其表达水平[J].南京农业大学学报,2008,31(1):1-5.

[19] 汪仁,沈文飚,翟虎渠.植物种子脂氧合酶[J].植物生理学通讯,2005,4(3):388-394.

[20] Kato T.Appearance of new lipoxygenases in soybean cotyledons after germ ination and evidence for expression of a major new lipoxygenase gene[J].Plant Physiol,1992,110:287-299.

[21] 姚锋先,曾晓春,蒋海燕,等.水稻中以亚麻酸为底物的脂氧合酶活性测定[J].江西农业大学学报,2006,28(2):183-186.

[22] 李强,吴晓露,李红伟,等.黄瓜果实脂氧合酶活性测定方法的建立[J].东北农业大学学报,2008,39(5):62-65.

[23] 陈昆松,徐昌杰,许文平,等.猕猴桃和桃果实脂氧合酶活性侧定方法的建立[J].果树学,2004,21(3):272-274.

[24] 侯美玲,苗华荣,王绍斌,等.花生种子脂肪氧化酶的活性测定研究[J].安徽农业科学,2008,36(32):14033-14035.

[25] Croft K P C,Slusarenko A J.Volatile products of the lipoxygenase pathway evolved from Phaseolus vulgaris L.leaves inoculated with Pseudomanassy ring as pv.phaseolicola[J].Plant Physiol,1993(1):13-24.

[26] Milan M A.An Arabidopsis thaliana lipoxygenase gene can be induced by pathogens;abscisic acid,and methyl jasmonate[J].PlantPhysiol,1993,101:441-450.

[27] Keppler L D,Novacky A.Initiation ofmembrane lipid peroxidation during bacteria induced hypersensitire reaction[J].Physiol Mol Plant Pathol,1987,30:233-245.

[28] Garnder H W.Biological roles and biochemistry of the lipoxygenase pathway[J].Hort Science,1995,30:197-205.

[29] 杨素铀,王秀春,曹仪植.绿豆子叶衰老过程中线粒体膜对几种氨基酸的透性[J].西北师范大学学报:自然科学版,1995,31(1):24-29.

[30] 魏建梅,刘长江,朱向秋,等.苹果果实发育成熟软化过程中脂氧合酶活性变化及采后乙烯调控[J].河北农业科学,2008,12(7):27-30.

[31] 李富军,翟蓄,杨洪强,等.1-MCP和AVG对肥城挑果实采后衰老的影响[J].果树学报,2004,21(3):272-274.

[32] 田寿乐,周俊义.不同贮藏温度与鲜枣果实中保护酶及脂氧合酶活性变化的关系[J].河北农业大学学报,2006,29(1):46-49.

[33] 刘艳,潘秋红,战吉 , 等.豌豆叶片内源水杨酸和茉莉酸类物质对机械伤害的响宬应[J].中国农业科学,2008,41(3):808-815.

[34] Galliard T,Phillips D R.Lipoxygenase from potato tubers[J].J Biochem,1971,124:431-438.

[35] Alobaid Y H M,Siddiqi A M.Properties of broad bean lipoxygenase[J].J Food Sci,1981,46:622-629.

[36] Hoyland D V,Taylor A J.A revies of the methodo logy of the 2-th iobarbituric acid test[J].Food Chemistry,1991,40(3):241-361.

[37] Suda I,Hajika M,Nishiba Y,et al.Simple and rapid method forth eselective detection of individual lipoxygenaseisozymes in soybean seeds[J].J Agric Food Chem,1995,43:742-747.

[38] Willams D C,Lim M H,Chen A O,et al.Anching of vegetables for freezing which indicator enzyme to choose[J].Food Techol,1986,40:130-140.

[39] 张瑛,吴敬德,童继平,等.植物脂肪氧化酶同功酶快速检测技术在无豆腥味大豆育种上的应用研究[J].大豆科学,2003,22(1):50-53.

[40] Hammod E G,Uvuck D N,Fehr W R,et al.Rapid screening techniques for lipoxygenases in soybean seeds[J].Crop Sci,1992,32:820-821.

[41] Da Silva Fortunato F,Goretide M,Oliveira A,et al.Lipoxygenase induced defense of soybean varieties to the attack of the velvet bean caterpillar[J].J Pest Sci,2007,80:241-247.

[42] 张波,李鲜,陈昆松.脂氧合酶基因家族成员与果实成熟衰老研究进展[J].园艺学报,2007,34(1):245-250.

[43] 张波,李鲜,陈昆松.EST库的猕猴桃脂氧合酶基因家族成员的克隆[J].园艺学报,2008,35(3):337-342.

[44] Porta H,Rocha-Sosa M.Lipoxygenase in bacteria:a horizontal transfer event[J].Microbiology,2001,147:31999-32001.

[45] Véronési C,Rickauer M,Fournier J,et al.Lipoxygenase gene expression in the tobacco-Phyophthora parasitica nicotianae interaction[J].Plant Physiol,1996,112:997-1004.

[46] Hildebrand D F,Rodriguen J G,Legg C,et al.The effects of wounding and infestat ion on soybean leaf lipoxygenase levels[J].Z Naturforsch,1989,44:655.

[47] Grechkin A.Recent developments in biochemistry of thep lant lipoxygenase pathway[J].Prog Lipid Res,1998,37(5):317-352.

[48] 刘南南,江玲,张文伟,等.水稻种胚LOX3基因在逆境胁迫中的作用[J].中国水稻学,2008,22(1):8-14.

[49] Peng Y L,Shirano Y,Ohta H,et al.A novel lipoxygenase from rice:primary structure and specific expression upon incompatible infectionwithriceblastfungus[J].JBiolChem,1994,269:3755-3761.

[50] Gozal B H,Yardena G D,Orna A K,et al.Preferential induction of a 9-lipoxygenase by salt in salt-tolerant cells of Citrus sinensis L.[J].Osbec Planta,2001,212:367-375.