奥沙利铂-碘油乳剂制备比例的试验研究

范芳，郝明志，林海澜#，杨琳，王劲，谢瑞祥(.福建省肿瘤医院药理实验室，福州市35004；.福建省肿瘤医院介入治疗科，福州市35004)

经导管肝动脉化疗栓塞术(Transcatheter arterial chemoembolization，TACE)是目前广泛应用于中、晚期肝癌的治疗手段，是不能手术切除肝癌的患者目前的首选治疗方法[1]。碘油在肝癌的化疗栓塞治疗中，除具有一定的栓塞作用外，还可作为化疗药物的载体，使药物具有一定的缓释作用，维持化疗药物在病变局部的高浓度，发挥化疗药物的抗癌作用[2]。在肝癌的化疗栓塞治疗中，顺铂、阿霉素等化疗药与碘油制成的乳剂已广泛用于肝癌的介入治疗中[3，4]，但到目前为止，肝癌介入栓塞化疗仍无标准方案。新药奥沙利铂在肝癌的化疗中取得了一定疗效，但其与碘油混合后的缓释作用和物理稳定性方面的研究则未见文献报道。本研究模拟二者临床实际应用比例及按无菌性要求制备符合肝动脉导管注射使用的奥沙利铂-碘油乳剂(Oxaliplatin-lipiodol emulsion)，以探讨其物理化学稳定性，为进一步临床应用提供借鉴。

1 材料

1.1 仪器

GOLD系统高效液相色谱(HPLC)仪，包括125型泵和168型DAD紫外检测器(美国Beckman公司)。

1.2 试药

超液态碘油(Ultra-fluide lipiodol，以下简称碘油，法国Guerbet公司，批号:071U013A，含碘:48%)；注射用奥沙利铂无菌粉末(批号:09041411，规格:每支50 mg)、奥沙利铂对照品(批号:619090601，纯度:99%)均由江苏恒瑞药业有限公司提供；5%葡萄糖注射液(5%GS，杭州民生药业有限公司，批号:10906091，规格:每袋250 mL)；乙腈为色谱纯，试验用水为双蒸水，其余试剂均为分析纯。

透析袋(美国联合碳化物公司，允许通过颗粒的分子量为8000～14000)。

2 方法与结果

2.1 奥沙利铂浓度的测定

2.1.1 奥沙利铂标准贮备液的制备。精密称取奥沙利铂对照品100.0 mg，用0.01 mol·L－1磷酸盐缓冲液溶解后定容至100 mL，即得1 mg·mL－1奥沙利铂标准贮备液。

2.1.2 色谱条件[5]。色谱柱为HYPERSIL ODS分析柱及预柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相:10%甲醇；流速:1 mL·min－1；检测波长:250 nm；柱温:室温；进样量:20 μL。

取“2.1.1”项下奥沙利铂标准贮备液、“2.4”项下空白溶液(5%GS-碘油乳剂(不含奥沙利铂)＝0.5∶5)及5%GS-碘油(0.5∶5)乳剂透析0.5 h透析液、5%GS-碘油(0.5∶5)乳剂透析24 h透析液进样分析，色谱见图1。

2.1.3 标准曲线的制备。准确吸取适量奥沙利铂标准贮备液，用0.01 mol·L－1磷酸盐缓冲液定容至10 mL，制成0.025、0.050、0.100、0.200、0.300、0.400、0.500 mg·mL－1的系列浓度的奥沙利铂标准溶液，依“2.1.2”项下色谱条件操作，对测得的奥沙利铂峰面积(Y)与奥沙利铂浓度值(X)进行回归得标准方程:Y＝0.131X+0.085(r＝0.9999)，结果表明奥沙利铂检测浓度线性范围为0.025～0.500 mg·mL－1。

2.1.4 精密度和回收率试验。在同日内测定5次和连续5 d每天测定1次浓度为0.025、0.100、0.400 mg·mL－1的标准溶液，依标准方程计算含量，计算精密度。结果，日内RSD分别为2.27%、1.86%、1.45%；日间RSD分别为1.45%、0.61%、1.87%。

制备奥沙利铂浓度为0.025、0.100、0.4 mg·mL－1的样品各6份，测定后依标准方程计算出相应的分析浓度，与实际浓度相比较计算出相对回收率。结果平均相对回收率为99.90%，RSD＝1.89%。

2.1.5 稳定性试验。将一定浓度的奥沙利铂溶液置于37℃水浴中，分别于0、2、4、8、12、24 h取样测定奥沙利铂的浓度，结果RSD＝1.07%，表明奥沙利铂溶液在测定条件下稳定。

2.2 不同比例奥沙利铂-碘油乳剂的制备

取50 mg奥沙利铂分别溶解于0.5、1、2、2.5 mL的5%GS中，再分别与5 mL的碘油混合后置于注射器中，用“单泵法”来回抽20次，停5 min后再抽20次，制成5%GS与碘油比例为0.5∶5、1∶5、2∶5、2.5∶5的乳剂。

2.3 物理稳定性的考察[6]

将“2.2”项下制备的乳剂置于400倍普通显微镜下观察乳滴的大小及分布。在显微镜下可观察到，5%GS与碘油的比例为2.5∶5的乳剂乳化不充分，乳滴大小分布不均匀，在油相中可见较多大液滴；2∶5比例的乳剂大液滴数量明显降低，但仍可见较大直径的液滴；1∶5比例的乳剂乳滴大小分布较均匀；0.5∶5比例的乳剂视野中未见较大直径的液滴，乳滴大小分布更为均匀。乳剂乳滴分布越均匀表明乳化越好，故以0.5∶5比例为最佳。

将“2.2”项下制备的乳剂静置于试管内24 h(试管置于37℃恒温水浴锅内)，观察不同时间奥沙利铂-碘油乳剂中油水分层情况，结果见表1。

表1 5%GS与碘油不同比例所制乳剂的分层时间Tab 1Stratification time of Oxaliplatin-lipiodol emulsion prepared by different proportion of 5%GS to lipiodol

由表1可见，随着5%GS用量的增加，乳剂的稳定性下降。5%GS与碘油的比例为0.5∶5的乳剂最稳定，超过24 h未见其分层。

2.4 体外药物释放试验[7]

吸取“2.2”项下制备的乳剂2 mL，分别放入透析袋中并置于含100 mL磷酸盐缓冲液(0.01 mol·L－1，pH＝7.0)的透析液的烧杯中，置于37℃恒温水浴锅中透析。分别于0.5、1、2、4、6、8、10、12、24 h取样0.2 mL，每次取样后均吸取等量的新鲜磷酸盐缓冲液加入透析液中。分析奥沙利铂-碘油乳剂(5%GS-碘油＝0.5∶5)透析0.5 h和24 h后透析液中奥沙利铂的色谱，见图1c、d)，根据奥沙利铂标准方程计算透析液中奥沙利铂的浓度，根据公式计算出累积释放度[释放度＝(奥沙利铂测得的累积溶出量/奥沙利铂总加入量)×100%]。以不同比例的5%GS-碘油乳剂(不含奥沙利铂)为空白溶液，将50 mg奥沙利铂溶于5 mL的5%GS中，制成浓度为10 mg·mL－1的奥沙利铂-5%GS溶液作为无缓释作用的对照。

不同比例的奥沙利铂-碘油乳剂中奥沙利铂的释放曲线见图2。

图2 不同比例的奥沙利铂-碘油乳剂的释放曲线Fig 2Release curves of different proportion of Oxaliplatin-lipiodol emulsion

与奥沙利铂-5%GS水溶液相比，不同比例的碘油乳化剂均有缓释作用。5%GS与碘油的比例为2.5∶5、2∶5时的乳剂释放快且不稳定；相比较前两者，比例为1∶5的乳剂缓释作用得以提高；而比例为0.5∶5的乳剂具有优良的缓释作用，奥沙利铂释放缓慢且稳定。体外释放试验的结果与乳滴分布及油水分层现象基本吻合。经计算，释放到透析液中奥沙利铂的量和透析袋中经透析后的乳剂破乳后测定的奥沙利铂的量的总和与加入量大致相当；同时，由图1d可见，经24 h透析后，透析液色谱上仍仅见奥沙利铂单一的峰，未有其它杂峰，可见，奥沙利铂在碘油-5%GS乳剂中具有稳定的物理化学性质。

3 讨论

随着栓塞剂和栓塞方法的改进，TACE已成为非手术治疗肝癌的有效手段。超液态碘油由于黏度低，容易经过较细的导管注入较细小的肿瘤血管而作为化疗药物的载体，可与化疗药物制成乳剂或混悬剂，经导管注入肝动脉，可使化疗药从基质中缓慢释放，从而改变化疗药的释药速度，提高化疗药在肝组织中的浓度，延长化疗药的作用时间，降低其系统毒性[7]。乳剂的乳滴大小、物理稳定性和释放度是决定栓塞用乳剂或混悬剂疗效的的重要因素。

奥沙利铂为水溶性药物，不溶于碘油，与碘油形成的乳剂为W/O型，随着水相的比例增大，形成均匀乳剂越困难。水相与油相的比例降为0.5∶5时，所用的5%GS既可很好地溶解奥沙利铂，又易与碘油形成稳定的乳剂，甚至不需采用“双泵法”或超声乳化，仅需“单泵法”即可，大大简便了临床操作。水相与油相的比例低于0.5∶5时，由于水相过少未能充分溶解奥沙利铂反而不易操作。

在体外释放度试验中，由色谱可见，整个释放过程中仅见奥沙利铂的峰，未见其它杂峰，表明奥沙利铂-碘油具有良好的物理化学稳定性，且具有良好的缓释作用，因而具有临床适用性，为肝癌的介入治疗提供了一种新的栓塞化疗选择方案。

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