乙型脑炎病毒减毒SA14-14-2-B3株基因组全序列分析

张学涛，赵明秋，琚春梅，赵启祖，康艳梅，沈海燕，陈金顶*

(1.华南农业大学兽医学院，广东广州510642；2.中国兽医药品监察所，北京100081)

流行性乙型脑炎(Japanese B encephalitis，JE)是由黄病毒科黄病毒属的JE病毒(JEV)引起的严重中枢神经系统疾病，以高热、狂躁或沉郁等神经症状为特征[1]。该病以蚊为媒介传播，属于人畜共患的自然疫源性传染病，对蚊虫的传播控制和对易感人群及动物的免疫接种是主要控制手段[2]。JEV的基因组为单股正链RNA，全长约11 kb，包括5'和3'端的非编码区(UTR)及一个开放读码框架(ORF)，该ORF编码一个多聚蛋白，可裂解加工成3个结构蛋白(C、PrM和 E)和7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)[3]。国外学者对JEV强毒株与减毒株的基因组全序列进行了测定与分析，推测几个氨基酸的变化与毒力减弱有关[4-6]。为进一步了解目前我国使用的JEV减毒疫苗株基因组序列特点，从基因组水平上了解其变异和分子遗传特性，本研究将猪乙型脑炎活疫苗株SA14-14-2进行传代，并对其基因组进行测序分析，以确认其与毒力弱化相关的位点，找出与毒力相关的基因特征，为研究疫苗株在使用过程中基因组稳定性等问题提供可靠的材料，同时也为进一步构建乙脑减毒活疫苗株的全长cDNA克隆奠定基础。

1 材料和方法

1.1 病毒株与试剂 猪JE活疫苗株SA14-14-2在BHK-21细胞上传至 3代并命名为 SA14-14-2-B3；SuperscriptⅢ反转录酶购自Invitrogen公司；RNA抽提试剂 TRIzol Reagent、LATaqDNA聚合酶和pMD18-T载体购自TaKaRa公司；胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自Omega公司。

1.2 引物设计 根据GenBank中JEV基因组序列，设计了8对引物，由上海生工生物工程技术服务公司合成(表 1)。

1.3 病毒基因组的RT-PCR扩增 参照TRIzol Reagent试剂说明书抽提病毒SA14-14-2-B3株的总RNA，以总RNA为模版，以Random primer(6)为引物，在SuperscriptⅢ反转录酶作用下，合成cDNA第一链。再以合成的cDNA为模板，用表1中的引物分别进行PCR扩增。

表1 扩增JEV基因组的引物Table 1 Primers for JEV amplification

1.4 基因的克隆、测序及分析 将PCR产物纯化回收，分别连接于pMD18-T载体中，选取阳性重组质粒进行序列测定，将各基因的测序结果拼接成完整的全长基因组序列，并推导其ORF编码的氨基酸序列。利用DNAStar软件对基因组序列进行分析。

2 结果与讨论

2.1 基因的RT-PCR扩增 利用设计的8对引物对JEV SA14-14-2-B3株的RNA进行RT-PCR扩增，获得了8个基因片段，各片段大小与预期相符。证明所设计的引物能够成功扩增JEV SA14-14-2-B3株的RNA，为其基因组全序列的测定奠定了基础。

2.2 SA14-14-2-B3株基因组序列获取及分析 对JEV SA14-14-2-B3株的8个cDNA片段分别进行序列测定，将获得的基因序列进行拼接后获得了SA14-14-2-B3株基因组全序列。SA14-14-2-B3株基因组全长为10 977 nt，含有一个单一的ORF，5'端为 95 nt的UTR，3'端为583 nt的 UTR。从 96 nt到10 394 nt为ORF，共10 299 nt，编码3 432个氨基酸。本研究所获得的SA14-14-2-B3株基因组核苷酸序列与其他学者发表的疫苗株SA14-14-2、SA(A)基因组序列存在差异[5,7]，推测这些不同位点的产生可能与毒株的不同代次有关，与毒株减毒关系不大。

通过与多个强毒株的序列比较，表明本研究中SA14-14-2-B3株序列存在下列7个氨基酸的突变，分别位于 E-138、E-176、E-315、E-439、NS2B-63、NS3-105、NS4A-225位点，尤其是E-138和E-176两个位点氨基酸的突变可能改变了E蛋白对细胞受体的吸附性，或者引起该病毒对其它细胞不可穿透，从而导致病毒毒力减弱，这与以往报道一致[6]。JEV除编码区外，非编码区的核苷酸序列也可能与病毒毒力相关，本研究毒株SA14-14-2-B3中5'端-39、-59和3'端-10 428、-10 956也存在突变，但这些区域上的位点变异对JEV毒力的变化能产生多大程度的影响，仍有待进一步研究。

2.3 SA14-14-2-B3株基因组序列相似性比较及分析 对SA14-14-2-B3株核苷酸和氨基酸序列进行分析表明，该毒株在核苷酸水平上，与国内疫苗株SA14-14-2、国外疫苗株SA(A)、野毒株SA14及国内猪源分离株HW、WHe的序列相似性均较高，分别为99.8%、99.9%、99.4%、98%和98.1%，而与2007年国内猪源分离株HEN0701及国外猪源分离株JEV/sw/Mie/40/2004、KV1899、FU的序列相似性较低，分别为88.5%、89%、88.5%和89.1%；在氨基酸水平上，得到了与核苷酸水平一致的分析结果。

对JEV SA14-14-2-B3株与SA14源病毒株基因组分析显示，SA14-14-2-B3株基因组第10 700位插入一个碱基G，与其他JEV毒株的基因组比较表明，其他JEV毒株在该处也存在碱基G，推测该位点可能是JEV易变区。

2.4 SA14-14-2-B3株遗传进化分析 本研究基于SA14-14-2-B3株的全基因组和E基因，应用MEGA4软件分别对其进行遗传进化关系分析。全基因进化分析表明：SA14-14-2-B3株与SA14源病毒株SA14、SA14-14-2、SA(A)、SA(V)及国内JEV分离株Beijing-1、p3、WHe、HW同处一个分支，遗传关系较近，而与国内猪源分离株HEN0701株和国外猪源分离株JEV/sw/Mie/40/2004、KV1899、FU处在不同的分支，遗传关系较远(图1)。

E基因进化分析表明：SA14-14-2-B3株与SA14源病毒株 SA14、SA14-14-2、SA(A)、SA(V)及国内 JEV分离株 Beijing-1、p3、WHe、HW 同属于JEV基因Ⅲ型，另外两个国内JEV分离株XJP613和HEN0701属于JEV基因Ⅰ型(图2)。由E基因构建的系统发育树显示4个明显的分组，这与以往将JEV分为GⅠ～GⅣ4个不同基因型一致[8]，由此推断我国已存在JEV基因Ⅲ型和基因Ⅰ型的共循环。通过国内外JEV不同分离株之间亲缘关系的探讨，推测目前的基因Ⅲ型疫苗株SA14-14-2-B3对我国的基因Ⅲ型分离株Beijing-1、p3、HW、WHe可能产生较好的保护，而对基因Ⅰ型分离株XJP613和HEN0701能否产生很好的保护，尚需进一步研究。

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