猬迭宫绦虫广东分离株线粒体pcox1基因的克隆及序列分析

李 淳，李明伟，刘国华，朱兴全，林瑞庆*

(1.华南农业大学兽医学院，广东广州510642；2.广东海洋大学农学院，广东湛江524088)

猬迭宫绦虫(Spirometra erinaceieuropaei)是一种人兽共患寄生绦虫，其中间宿主为蛇及两栖动物，终末宿主为犬、猫等肉食动物[1]。该寄生虫可通过消化道或伤口感染人，人食入未煮熟的蛇或青蛙肉，或伤口及炎症部位接触被感染的动物组织均可感染[2]。幼虫感染人后，可移行到机体各组织器官引起裂头蚴病[3]。线粒体基因组具有分子较小、进化速率高和母性遗传等特点[4]，其中细胞色素c氧化酶第Ⅰ亚基(cox1)基因已被证明是研究猬迭宫绦虫遗传变异的有效标记[5]。单链构象多态性(Single-strand conformation polymorphism，SSCP)技术是一种基于DNA构象差别来检测点突变的方法，能快速有效地检测出DNA短片段中存在的单核苷酸突变[6]。本研究应用PCR方法扩增出采自广东地区的猬迭宫绦虫的线粒体cox1基因部分序列(pcox1)，通过SSCP技术及测序分析其遗传变异情况，并利用pcox1构建猬迭宫绦虫不同地理位置的遗传进化关系，从而明确在不同猬迭宫绦虫虫株之间pcox1是否存在差异。

1 材料和方法

1.1 虫体样品 本实验所用的猬迭宫绦虫样品采自广东茂名、云浮和湛江地区(表1)。

表1 本实验所用猬迭宫绦虫样品Table 1 Spirometra erinaceieuropaeiisolates used in the present study

1.2 主要试剂Taq酶，PCR试剂为宝生物工程(大连)有限公司产品；蛋白酶K为Merck公司产品；WizardTMDNA Clean-up System为Promega公司产品。

1.3 样品DNA的制备 按照基因组DNA提取试剂盒使用说明书提取猬迭宫绦虫基因组DNA，-20℃保存备用。

1.4 PCR扩增 采用文献[7]的引物JB3和JB4.5来扩增线粒体pcox1基因，引物由上海生工生物技术有限公司合成。反应体系为25 μL，扩增条件为：94 ℃5 min；94 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃30 s，共37个循环；最后72℃5 min；PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，观察结果。PCR产物保存备用。

1.5 SSCP分析 取阳性PCR产物3.5 μL，混合等量上样缓冲液(95%甲酰胺、20 mmol/L EDTA、0.03%二甲苯蓝和0.05%溴酚蓝)，94℃变性5 min，冰浴2 min，0.5×MDE胶电泳(18℃～20℃，97 V，140 min)[8]，溴化乙锭染色30 min，紫外投射仪下观察结果。

1.6 pcox1序列测定及其在种系发育分析中的应用将通过SSCP分析筛选的代表性样品的PCR产物由上海生工生物技术有限公司测序，测序结果用DNAStar 5.0软件进行分析。利用Clustal X1.81软件对获得序列进行比对，应用Phylip 3.67程序中的最大简约法(Maximum parasimony，MP)和Mega 4.0程序中的临接法(Neighbor-joining method，NJ)绘制种系发育树，并应用Puzzle 5.2程序的最大似然法(Maximum Likelihood，ML)构建系统发育树。临接法在软件默认设置下进行分析；最大简约法采用Branch and bound模型分析，采用自展检验(Bootstrap test)估算所构建系统树的可靠性，ML法采用Hky替代模型和Quartet puzzling搜索程序进行分析，复制数均为1000。

2 结果与讨论

2.1 PCR扩增结果 115条猬迭宫绦虫样品均成功地扩增出约450 bp的片段，与预期pcox1目的片段大小相符，并且无非特异性条带(图1)。

2.2 SSCP结果 115条猬迭宫绦虫样品的pcox1 PCR扩增产物进行SDS-PAGE电泳，取条带有一定差异的31个样品为代表，进行SSCP电泳分析(图2)。选择其中24个样品的PCR产物直接测序。

2.3 测序结果及分析 24个代表样品pcox1碱基序列长度相同，均为444 bp，去除引物后均得到396 bp的序列。样品序列与GenBankTM收录的猬迭宫绦虫的相应序列(AB374543)进行比较，相似性均高于98%。广东分离株之间的相似性均高于98%，广东分离株与GenBankTM中其它绦虫cox1序列的相似性均低于85%。采用NJ法、MP法和ML法构建的系统发生树(图3)显示，广东分离株(SeFY01，SeFM01，SeFZ03，SeDZ09)具有高度同源性，与GenBankTM中报道的猬迭宫绦虫位于同一分枝，广东分离株所属分枝与其他绦虫所属分支相隔较远。

由于猬迭宫绦虫pcox1序列种内相对保守，又存在一定种间差异，可作为种间遗传变异研究的标记。本研究结果为进一步研究猬迭宫绦虫的群体遗传结构奠定了基础。

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