猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗研究进展

吴佳俊，遇秀玲，蒋桃珍，田克恭*

(1.中国动物疫病预防控制中心，北京 100193；2.中国兽医药品监察所，北京 100081）

猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗研究进展

吴佳俊1，遇秀玲1，蒋桃珍2，田克恭1*

(1.中国动物疫病预防控制中心，北京 100193；2.中国兽医药品监察所，北京 100081）

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）又称“猪蓝耳病”，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV）引起的猪的一种高度接触性传染病，不同年龄、品种和性别的猪均能感染，但以妊娠母猪和1月龄以内的仔猪最易感；该病以母猪流产、死胎、木乃伊胎、弱仔以及仔猪咳嗽、气喘等呼吸症状为主要特征。该病从20世纪80年代后期出现以来，已给全球的养猪业造成严重的经济损失。为了有效地控制该病，国内外已开发出多种用于预防PRRS的灭活疫苗。在PRRS灭活疫苗研制中，疫苗毒株、病毒培养条件、灭活工艺和佐剂是研发有效疫苗的关键。本文就PRRS灭活疫苗研究的最新进展进行了综述。

1 疫苗毒株的选择

疫苗毒株是决定PRRS灭活疫苗质量的最关键因素之一。目前PRRSV主要有欧洲型和美洲型两大类型，两者核苷酸序列同源性只有60%左右；即使是同一个类型，不同PRRSV株的同源性也不高，最低的只有85%，这是因为PRRSV的变异速度相对较快。Hanada等分析了过去十多年PRRS病毒的全基因序列，提出PRRSV病毒的进化率(10-2/位/年）要明显高于其他RNA病毒(10-3～5/位/年）[1]。因此，选择PRRS灭活疫苗生产用的毒株必须具有代表性，应与疫病流行地区分离毒株具有高度同源性。目前国内外已有多种针对美洲型PRRSV株(CH-1a、ISU-P、JXA1、VD-A1）与欧洲型 PRRSV株(LV、VD-E1、VD-E2）的商品化灭活疫苗，疫苗研制者称这些疫苗免疫动物都能很好的抵御来自疫苗同源强毒株的攻击[2-7]。此外，还有一些灭活疫苗正处于研发和审批阶段，包括欧洲型的PRRS-CY-218-JPD-P5-6-91 Or Olot株[8]，以及美洲型的SD-1 株[9]等。

由于PRRS疫苗的免疫保护机制尚不十分清楚，因此灭活疫苗的保护力一直备受质疑。Swenson等证实，PRRS灭活疫苗可以缩短攻毒后公猪精液中病毒的持续时间[11]；但两年后Nielsen用来源相同的灭活疫苗(PRRomiSeR，英特威，疫苗株VR-2402）免疫公猪，结果却没能减少精液中的病毒含量[10]。两个试验不同之处在于前者使用的攻毒株与疫苗株相同(即VR-2402），后者使用的攻毒株是VR-2385，这表明灭活疫苗的交叉保护力较弱。也有学者对此表示异议，Stadejek等发现，欧洲型PRRSV株制备的灭活疫苗不能保护猪群抵抗欧洲型PRRSV强毒株(PRRSV LV株）的攻击，但欧洲型PRRSV株的弱毒疫苗则可以提供较好的保护作用[12]。灭活疫苗与LV株GP5蛋白的同源性为99%，而弱毒疫苗的相关同源性只有93%，以上结果是建立在中和抗体有效的基础之上。此外，Osorio和Scortti等的试验表明，弱毒疫苗对不同亚群的PRRSV强毒(都属于同一类型），其交叉保护力分别为50%和85%，因此，灭活疫苗的保护效力与毒株的同源性密切相关，但PRRS弱毒疫苗的交叉保护性要更优于灭活疫苗。

为了解决灭活疫苗交叉保护性较差的问题，以下两种方法或许可以提供借鉴：一是使用自家苗，国外MJ Biologics公司研制出了一种PRRSV亚单位灭活疫苗技术[13]，主要应用于自家苗的生产。二是开发PRRS多价灭活苗，勃林格殷格翰公司2004年在中国申请的弱毒疫苗专利包括了两个疫苗株(疫苗株ATCC保藏号分别为PTA-6281和6282）[14]；2005年韩国公司申请的中国专利，其PRRS二价灭活疫苗的生产种毒也包含了两个疫苗株，即VR-2509(MN-HS毒株）与CNV-1[3]；欧洲捷克Dyntec公司生产的PRRS灭活疫苗，SUIVAC PRRS-INR含有3个PRRS疫苗株；SUIVAC PRRS-INeR含有2个PRRS疫苗株，其中的一株属于美洲型。

2 病毒培养

为提高PRRS灭活疫苗的效力，一是确保疫苗在灭活前含有较高滴度的病毒，二是尽量保持疫苗病毒株的免疫原性。因此，如何保证病毒的免疫原性同时又能获得高滴度的病毒培养液是疫苗生产中的关键技术。

增加病毒在细胞培养中的传代次数可以提高病毒的TCID50，但细胞传代可明显降低病毒的免疫原性，如何平衡病毒滴度和免疫原性之间的关系，是PRRS灭活疫苗研究的关键。目前用于PRRS灭活疫苗生产的病毒的培育代次普遍不高。另外，合适的培养细胞也能提高病毒的TCID50，Marc-145 细 胞[5,9,15-21]和 MA-104 细胞[22]是 目 前PRRS灭活疫苗生产的主要细胞系，此外的生产细胞系还有猪肺泡巨噬细胞、猪睾丸细胞或A-72细胞[3]。Thomas等学者还对MA-104细胞系进行克隆，得到9009B细胞，ISU-P毒株对它的适应性要高于未克隆的MA-104细胞[22]。

灭活疫苗在灭活和乳化过程中会使其丧失部分免疫原性，因此灭活前疫苗的病毒含量必须达到一定标准。目前大多数PRRS灭活疫苗，其灭活前的病毒含量在107～108TCID50/mL之间[5-6,21,23-24]，但也有病毒滴度较低的，只有105～106TCID50/mL[3,18,22]。此外，不同的疫苗毒株接种细胞后，细胞病变(CPE）出现的时间也有所差异，CPE达到 80%的病变较早的毒株只需培养 24 h～36 h[21]，而较迟的大约需要3 d～5 d，例如韩国株式会社中央疫苗研究所的MN-HS和CNV-l疫苗株[22]。

收获病毒常用反复冻融的方法，冻融次数一般在2次以上。冻融的时间、体积、容器、温度和次数十分重要，它们直接影响病毒的回收率。为了提高病毒的滴度，浓缩技术也常常用于病毒回收[3]。

3 病毒灭活工艺

病毒灭活工艺的选择一是要确保PRRSV灭活彻底，二是要考虑其对PRRSV免疫原性的影响。病毒灭活常用的工艺包括物理和化学方法，前者主要有加热、超声波和射线，以射线最为常用，这些方法曾经被用于新城疫、猪瘟、禽霍乱等病原的灭活，现在病毒疫苗生产中很少使用；后者包括甲醛、烷化剂类(AEI/BEI）、β-丙酰内酯(BPL）、硫柳汞钠盐、苯酚、结晶紫、非离子型去垢剂(如Trixton-X100）。甲醛是第一个被用于生物制品的化学试剂，随后结晶紫被用于猪瘟疫苗的灭活，目前BPL、AEI、Trixton-X 100开始应用于疫苗的灭活工艺。一般来说，灭活剂剂量增大，温度升高，灭活的效率提高。但灭活应该以较低的温度、较短的时间和最低的剂量为指导原则，同时注意pH值的变化，以中性为宜。如果灭活的蛋白含量高，应增加剂量，否则灭活不完全；为了保护免疫原性，有时可以考虑采用小量分次加入甲醛溶液进行灭活、调节pH值由低到高，温度由室温逐步提高到允许的最高温度[25]。

甲醛仍是目前PRRS灭活疫苗的主要灭活方法，其基本原理是还原作用，它既能导致PRRS病毒丧失活性，又可保持其免疫原性，一般的使用浓度为0.05%～0.25%[3,6,16-17,21,23]。近年来，BPL、BEI以及Triton-X100等灭活剂也开始应用于PRRS灭活疫苗。Thomas等用终浓度为0.05%BEI灭活PRRS病毒，取得不错的免疫效果[22]；Duran等用终浓度为2%的BPL灭活PRRS病毒，4℃过夜后用0.5 M的NaOH调pH值至7.4，最后置37℃1 s，也取得很好的免疫效果[7]；Harris等用TT(Trizma/Tricine）缓冲液悬浮PRRS病毒后，加入终浓度为0.1%的Triton-X100，4℃搅拌过夜以灭活病毒。此外，英特威公司的PRRS灭活疫苗(PRRomiSeR）采用了一种新的灭活工艺SofkilTM，据称可以使PRRS灭活疫苗达到最佳的免疫效果。

4 佐剂

佐剂对于灭活疫苗的免疫效果至关重要。常用的佐剂主要有不溶性铝盐、矿物油佐剂、蜂胶、微生物及其代谢产物、免疫刺激复合物(ISCOM）和细胞因子类。矿物油佐剂在兽用疫苗生产中最为常用，也是目前PRRS灭活疫苗使用的主要佐剂。尹寅重和王隆柏等研制的PRRS灭活疫苗则分别使用了新型油佐剂IMS1313 NPR和IMS1312[13,17]；英特威公司生产的灭活疫苗PRRomiSeR使用了一种新的佐剂SPURR，更有助于提高PRRS灭活疫苗的免疫效果。其他佐剂还包括蜂胶[16]、CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN）[27]和左旋咪唑[28]等。

使用不同佐剂的PRRS灭活疫苗，其免疫效果存在一定差异。矿物油佐剂(Marcol52为矿物油，Simulsol 5100和Montanide888为乳化剂）的PRRS灭活疫苗要好于Munkynin佐剂(美国Cyanamid公司提供，主要是氢氧化铝和Quil A），前者二免的血清抗体阳转比例和平均抗体滴度都高于后者[7]。Carbopol是一种铰链的丙烯酸聚合物，能有效浓聚抗原，使不可溶的成分持久悬浮，免疫刺激微弱，不激发圆环病毒发病。Carbopol类佐剂PRRS灭活疫苗，其免疫效果要好于FIA/FCA和佐剂B(Dia-mond Scientific）：当甲醛作为灭活剂，Carbopol佐剂组的平均抗体滴度分别是其他两者的3和10倍；当BPL作为灭活剂，Carbopol佐剂组的平均抗体水平分别是其他两者的16和20倍[29]。美国富道公司猪支原体疫苗也使用该型水质佐剂，并申请了专利。此外，普通油水佐剂的PRRS灭活疫苗免疫效果要好于新型佐剂IMS1312，前者免疫后的抗体水平大约是后者的2倍左右[17]。

5 PRRS疫苗的免疫效果评价

目前评价PRRS疫苗效力主要依靠免疫攻毒保护试验，辅助的评价试验包括抗体和细胞因子评价试验以及模型替代试验。免疫攻毒保护试验需要PRRSV阴性猪，而国内PRRS阴性猪群数量已经很少，加之该试验的周期较长，成本较高，而且需要一定安全级别的动物饲养设施。因此，需要研究用实验动物或血清学的评价方法替代目前的本动物免疫攻毒保护评价方法。

中和抗体曾被认为是评价PRRS疫苗免疫效果的重要指标，因为有学者报道它能保护猪抵御PRRSV的攻击。例如，Joo等对中和抗体阳性和阴性猪进行攻毒试验，阴性猪出现病毒血症，而阳性猪没有出现；Osorio等给怀孕母猪注射中和抗体，注射猪攻毒后所有怀孕母猪都十分健康，未出现繁殖障碍问题，在血清中也未能检测到PRRSV[30]。因此，尹寅重]等建立了豚鼠为模型、中和抗体为检测指标的替代试验[3。为了验证该模型的有效性，设立了豚鼠组和阴性猪群组，首免后3周加强免疫，加强免疫2周后采血，检测中和抗体水平与猪模型有很好的相关性。

也有学者对中和抗体的作用提出了质疑，Zuckermann的实验结果表明弱毒疫苗(Pyrsvac-183）产生的中和抗体滴度不高，但可以提供很好的保护作用[31]；灭活疫苗(ProgressisR）可以刺激猪体产生较高水平的中和抗体，却不能保护猪体免受PRRS病毒的攻击；Nilubol等[10]发现阳性猪接种英特威公司的PRRomiSeR灭活疫苗后产生较高水平的中和抗体，但不能抵御PRRS强毒株的攻击。目前人们逐步把目光转移到γ-干扰素和细胞因子类，但它们之间的相关性仍不可靠，Nilubol认为γ-干扰素的升高很可能是受免疫佐剂的影响[10]。

6 国内外主要商品化的PRRS灭活疫苗的应用情况

英特威公司生产PRRomiSeR灭活疫苗，它能有效缩短妊娠母猪的病毒血症时间。母猪妊娠前50 d接种该疫苗，21 d加强免疫，二免后14 d用ISU-P强毒株进行攻击。结果显示攻毒后的4 d和7 d，免疫猪与对照猪都能检测到PRRSV，但14 d后只有1/7的免疫猪可以检测到PRRSV，免疫组的母猪分娩时未能检测PRRSV；33%的对照在分娩时仍可检测到PRRSV。

勃林格殷格翰公司生产的Ingelvac PRRS KVR灭活疫苗，安全性高，已成功应用于20个猪场，共计4 000头母猪。免疫的母猪分娩时只有5%的木乃伊胎与死胎，未免的母猪其比例高达30%。此外，17个PRRSV阳性猪场(共4 880头猪）的田间试验证明，免疫组的抗体水平(IPMA）要比对照组高、持续时间更长；免疫组分娩的小猪，4周龄时的病毒血症比例只有0.4%，对照为2.6%，且它的抗体水平有56%维持较高的水平，对照只有37%。

梅里亚公司生产的PROGRESSISR灭活疫苗可以有效提高抗体水平与分娩仔猪的成活率。该公司在法国17个PRRSV阳性猪场进行了田间试验，其中一个猪场的3批母猪(433头）进行免疫，2批母猪(412头）作为对照，结果表明免疫组的抗体阳性率一直维持在80%～90%，对照只有50%～70%；免疫组小猪的死亡率相比对照组要降低59%，而且一年免疫4次的小猪死亡率比免疫两次的低36%。

7、小结

PRRS灭活疫苗免疫初生仔猪，只能诱导出低水平的免疫应答，如果在PRRSV阳性猪群使用灭活疫苗，包括野毒感染或接种过弱毒疫苗的猪群，都能提高猪体的中和抗体水平[10,32]，相反，如果使用弱毒疫苗，可能减弱中和抗体水平。而且灭活疫苗安全，不散毒，不存在毒力返强的危险，常用于受到威胁的PRRS阴性群或种猪场。因此，合理地利用灭活疫苗和弱毒疫苗的优点，取长补短，对于控制PRRS流行大有裨益。

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S858.28

B

1008-0589(2010）08-0655-04

10.3969/j.issn.1008-0589.2010.08.20

*Correspondingauthor

2009-02-23

“十一五”国家支撑计划(2007BAD86B01）、农业科技成果转化资金项目(2009GB23260435）

吴佳俊(1982-），男，助理兽医师，农学硕士，主要从事预防兽医学研究.

*通信作者：田克恭E-mail：tankg@263.net

(本文编辑：赵晓岩）