舒阴液洗剂微生物限度检查方法学验证

2010-07-30魏旭兰

中国医药指南 2010年2期

魏旭兰熊青

舒阴液洗剂是本所临床经验方，在临床应用已有30余年，专为治疗各种病菌引起的外阴搔痒、外阴炎、外阴湿疹、阴道炎、尖锐湿疣而设，并能治疗由各种真菌引起的皮肤病。为保证药品质量，按照中国药典2005版[1]的要求，对其微生物限度检查方法进行验证，现报道如下。

1 实验材料

1.1 培养基

营养肉汤增菌液（批号060622），营养琼脂培养基（批号070110），玫瑰红钠琼脂培养基（批号070315），胆盐乳糖增菌液（批号060422），甘露醇氯化钠琼脂培养基060920），溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基（批号060521），均购自中国生物制品检定所。

1.2 菌种

大肠埃希菌[CMCCB44102]第2代，枯草芽孢杆菌[CMCCB63501]第2代，金黄色葡萄球菌[CMCCB26003]第2代，白色念珠菌[CMCCF98001]第2代，黑曲霉菌[CMCCF98003]第2代，将大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌分别接种肉汤营养琼脂斜面，培养24h，白色念球菌接种于改良马丁琼脂斜面，培养48h，黑曲霉接种于改良马丁琼脂斜面，培养7d，分别用生理盐水将其稀释成 10-4～10-11，取菌落数在50～100cfu/mL范围的菌稀释液，作为阳性菌对照液。

1.3 稀释液

pH=7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。

1.4 样品

舒阴液洗剂（本所制剂室，批号20070319）。

2 方法

2.1 直接接种法供试液制备

量取供试品10mL3份，加入pH=7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100mL，直接混匀，制成1∶10供试液，取2mL分别加入置2个平皿中。

2.2 直接接种法菌液制备

取1∶10供试液2mL，分别加入置2个平皿中，再分别加入大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉菌50～100个菌/mL的菌液1mL，作为加阳性菌供试液样。每种菌制备2份。

2.3 培养基稀释法供试液的制备

将1∶10供试品溶液1mL，分别注入10个平皿中，每个0.1mL，10个为一组，共两组。

2.4 培养基稀释法加阳性菌供试液的制备

将1∶10供试品溶液1mL，分别注入10个平皿中，每个0.1mL，10个为一组，再分别加入大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉50～100个菌/mL的菌液1mL，每种菌株两组。

2.5 操作步骤

2.5.1 直接接种法

取1∶10供试液2mL注入2个平皿中，分别加入大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉50～100个菌/mL 的菌液1mL，作为加阳性菌供试液样。每个菌制备2个平皿。

2.5.2 培养基稀释法

将1∶10供试液2mL，分别注入20个平皿，再分别加入大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉菌50～100个菌/mL的菌液1mL，每组10个平皿，每个菌株两组。分别加入已溶化保温至45℃营养琼脂培养基，玫瑰红钠琼脂培养基15mL。每1mL供试品溶液所注的平皿中生长的菌落之和为1mL，计算每1mL供试品溶液的平均菌落数，按平皿法计数规则报告菌落数。

2.5.3 大肠埃希菌检查

取1∶10供试品溶液10mL接种于胆盐乳糖培养基中，培养24h，取上述培养物0.2mL，接种至含5mL MUG培养基的试管内，培养，于5、24h在365nm紫外线观察，同时用未接种的MUG培养作本底对照。管内培养物呈现荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG印行。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试验，液面呈玫瑰红色，为靛基质阴性。MUG阳性、靛基质阳性，为检出大肠埃希菌；MUG阴性、靛基质阴性，为未检出大肠埃希菌。另取50～100个菌/mL的大肠埃希菌液1mL按上述方法植被添加大肠埃希菌的供试品阳性对照管；取50～100个菌/mL的金黄色葡萄球菌1mL按上述方法制备添加金黄色球菌的供试品阴性对照管。

2.6 培养

各平皿培养基凝固后，细菌检查平皿置30～35℃培养箱48h，霉菌检查平皿置23～28℃培养箱72h。

2.7 样品微生物限度测定

取供试品10mL，加pH=7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液90mL，混匀，分别按常规法和培养基稀释法各3份进行操作（表1～3）。

表1 直接接种法

表2 培养基稀释法

表3 大肠埃希菌检查结果

3 结果

由表1～3的结果可见，舒阴液洗剂以常规方法检查，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念球菌、黑曲霉各菌的平均回收率分别为70.5%、20.3%、67.4%、89.4%、100%。该样品对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的检出均有影响，而对白色念球菌、黑曲霉的加样回收率均高于70%，故认为常规法测定霉菌和酵母菌总数是符合中国药典2005年版的要求的；采用培养基稀释法金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌各菌的平均回收率分别为85.2%、100%、89.9%，均高于70%，故认为培养基稀释法测定细菌总数是符合中国药典2005版的要求的。控制菌检查舒阴液无明显的影响，故控制菌采用常规法进行检验。