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番茄红素对大鼠非酒精性脂肪肝的作用研究

2010-07-29赵春景

中国药业 2010年3期
关键词:计分匀浆番茄红素

魏 来,赵春景

(重庆医科大学附属第二医院药剂科,重庆 400010)

番茄红素是一种天然的生物抗氧化剂和功能性色素,具有保肝和抗急性肝损伤的作用[1]。它还具有多种生物学活性,其中调节血脂的作用正日益受到关注[2-3]。本研究通过建立非酒精性脂肪肝动物模型,了解番茄红素对大鼠非酒精性脂肪肝的防治作用及其可能的作用机制,报道如下。

1 材料与方法

1.1 试验材料

仪器:UV-1601型紫外分光光度计(日本岛津公司);AEG-220型电子天平(日本岛津公司);TJ-6型低温离心机(日本Olympus公司);低温冰箱(日本Sanyo公司);恒温水浴箱(成都医疗器械二厂);玻璃匀浆器(涿州市长虹玻璃仪器厂);HY-9211K型恒温振荡器(太仓市科教器材厂)。

药品与试剂:番茄红素油树脂(纯度为6%,新疆生命红红花开发有限责任公司,批号为20040302,使用时用色拉油将番茄红素油树脂稀释成25 g/L,备用);超氧化物歧化酶(SOD,批号为20050216)及丙二醛(MDA,批号为20050324)试剂盒,蛋白定量试剂盒(双缩脲法,批号为20050201),脂蛋白酯酶(LPL)试剂盒(批号为 20050211),肝脂酶(HL)试剂盒(批号为 20050211),胆碱酯酶(CHE)试剂盒(批号为20050325),均购于南京建成生物工程研究所;胆固醇(批号为20040605,上海生物化学公司)。

动物:Wistar大鼠,清洁级,雄性,60 只,体重(150 ±10)g,由重庆医科大学实验动物中心提供。

1.2 试验方法

动物分组:将60只大白鼠正常喂养1周后,随机分为5组。正常对照组(N组)10只,给予正常饲料。造模组50只,给予高脂饲料(88%普通饲料,10%猪油,2%胆固醇)[4-5]连续8周后,处死其中10只,做肝脏病理切片。HE染色显微镜下,10只大鼠肝脏病理切片均可见单位面积上超过1/3的肝细胞脂肪变性,肝细胞明显肿大,确定脂肪肝动物模型成功,将另40只造模大鼠随机分为4组,即模型对照组(M组),继续给予高脂饲料;低剂量组(L组)、高剂量组(H组),改食普通饲料,每天给予番茄红素(L组10 mg/kg,H组20 mg/kg)灌胃;自然恢复组(NR组),改食普通饲料,同时给予同体积的色拉油灌胃。均连续给药4周。

测定指标和方法:于连续用药4周末处死全部动物并检查。处死前称重,禁食不禁水(停药),24 h后腹腔注射2%异戊巴比妥70 mg/kg;麻醉动物后眼眶取血,3000 r/min离心15 min,分离血清,-20℃冰箱保存。打开腹腔,摘取肝脏,置天平上称重,然后取部分肝脏用生理盐水漂洗数次后,滤纸拭干;称取0.5~0.6 g,加入冰生理盐水5~6 mL,用玻璃匀浆器在冰水中进行碾磨匀浆,制成10%匀浆;10000 r/min 4℃离心30 min,取上清,-20℃冰箱保存。另取部分肝右叶,用10%甲醛固定,石蜡包埋,切片,HE染色,作肝脏病理组织学检查。

1.3 数据表达和统计学分析

所有数据均以均数±标准差表示,采用SPSS 11.0软件进行统计分析。进行方差分析和两两比较的 t检验,P<0.05表示有显著性差异。

2 结果

2.1 对大鼠肝功能及血脂的影响

结果见表1。与N组比较,M组天门冬酸氨基转移酶(AST)及谷氨酸氨基转移酶(ALT)水平均明显升高(P<0.01),甘油三酯(TG)、胆固醇(CHO)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、游离脂肪酸(FFA)均明显升高,高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)下降(P<0.01);与NR组比较,不同剂量的番茄红素(L组及H组)均能抑制因造模引起的AST及ALT水平升高(P<0.05或 P<0.01),且呈一定的剂量依赖趋势;与M组比较,不同剂量的番茄红素组(L组及H组)血TG,CHO,LDL-C及 FFA下降,HDL-C升高(P<0.05或 P<0.01)。

表1 番茄红素对非酒精性脂肪肝大鼠肝功能及血脂的影响(,n=10)

表1 番茄红素对非酒精性脂肪肝大鼠肝功能及血脂的影响(,n=10)

注:与 N 组比较,*P <0.01;与 NR 组比较,△P <0.05,▲P <0.01;与 M 组比较,#P <0.05,■P <0.01(下表同)。

组别 剂量[mg/(kg·d)]N组M组NR组L组H组肝功能(U/L)血脂(mmol/L)FFA 0.84±0.151.92±0.16*1.75±0.101.55±0.07#1.34±0.07#---1020 AST 175.4±14.52235.1±23.75*219.0±16.40*208.6±15.15Δ 192.2±16.03▲ALT 43.7±4.8373.1±6.49*68.5±7.56*53.1±5.51Δ 49.8±6.78▲TG 0.60±0.051.62±0.06*1.17±0.071.04±0.06#0.81±0.08#CHO 1.43±0.713.67±0.85*3.01±0.682.15±0.94#1.88±0.85■LDL-C 0.34±0.122.32±0.11*1.83±0.121.14±0.13#0.71±0.06■HDL-C 0.95±0.070.57±0.07*0.83±0.020.74±0.03#0.70±0.03#

2.2 番茄红素对大鼠肝组织匀浆SOD,MDA,CHE及血清CHE的影响

结果见表2。与N组比较,M组SOD活性明显降低,MDA含量明显升高(P<0.01),血清中 CHE 活性明显升高(P<0.01);与NR组比较,不同剂量的番茄红素组(L组及H组)SOD活性明显升高,MDA含量明显降低(P<0.05或 P<0.01),血清中CHE活性明显降低(P<0.05或 P<0.01);而肝组织中CHE的变化与血清中的变化相同。

表2 番茄红素对非酒精性脂肪肝大鼠组织匀浆SOD,MDA,CHE及血清CHE的影响(,n=10)

表2 番茄红素对非酒精性脂肪肝大鼠组织匀浆SOD,MDA,CHE及血清CHE的影响(,n=10)

组别N组M组NR组L组H组剂量[mg/(kg·d)]---1020 SOD(U/mgprot)101.78±11.7766.63±8.98*78.86±5.5270.80±6.72Δ 86.24±5.46▲MDA(NU/mgprot)3.09±0.595.49±0.93*4.87±0.764.23±0.70Δ 3.53±0.50Δ血清中CHE(U/mL)61.36±7.44111.31±11.44*99.48±10.7784.46±8.03▲75.79±8.76▲组织中CHE(U/mgprot)11.44±1.6739.36±2.67*30.58±3.6325.21±2.19Δ 19.15±1.94▲

2.3 肝组织病理学检查

N组大鼠肝小叶结构完整,肝索排列规则,肝细胞形态正常。M组大鼠均出现重度脂肪变性,肝细胞明显肿大,胞浆内充满以大泡型为主的脂肪空泡或脂滴,并伴有肝细胞的变性及坏死;脂肪变细胞以中央静脉周围较明显,呈极度肿胀,肝窦狭窄,未见纤维间隔形成。与M组比较,NR组、L组和H组大鼠肝脂肪变性程度和炎症均有不同程度的改善,其中以L组和H组改善较为显著。肝细胞脂肪变性计分参考文献[6]。肝细胞脂肪变性程度分级:“+”表示肝细胞脂肪变性程度不超过25%;“++”表示肝细胞脂肪变性程度在25%~50%之间;“+++”表示肝细胞脂肪变性程度在50% ~75%之间;“++++”表示肝细胞脂肪变性程度超过75%。计分时,“+”~“++++”依次视为1~4分。炎症活动度的计分参考Knodell的计分标准[7],汇管区和小叶内炎症程度分别计分,两者之和为每张切片的炎症活动度计分。具体计分标准为:汇管区或小叶内无炎症、坏死,计0分;小于1/3的汇管区或小叶内有炎症、坏死,计1分;1/3~2/3的汇管区或小叶内有炎症、坏死,计3分;超过2/3的汇管区或小叶内有炎症、坏死,计4分。参考文献[8],每张切片随机选取3个视野,每个视野将脂肪变性与炎症活动度分别计分,取其平均值。各组脂肪变性程度、炎症活动度和计分见图1及表3。

图1 番茄红素对非酒精性脂肪肝大鼠肝脏病理改变的影响(200倍光镜,HE染色)

表3 非酒精性脂肪肝大鼠肝脏病理学改变

3 讨论

非酒精性脂肪肝的相关病因很多,临床上主要指与肥胖、糖尿病和高脂血症相关的因素。其发病机制复杂,涉及细胞内的生化代谢,具体环节尚不完全清楚,一般认为与脂肪代谢异常、激素影响、环境因素、遗传因素、氧应激及脂质过氧化损伤、免疫反应、肝窦改变等有关[9],故临床上常用调脂药治疗脂肪肝。一些调脂药对脂肪肝有效[10-11],但许多调脂药虽然调脂效果确切却具有潜在的肝毒性,对肝内脂肪沉积无改善甚至反而加重肝损伤[12-13],因此兼有调脂和保肝双重作用的药物会更有利于脂肪肝的防治。番茄红素是一种类胡萝卜素,具有强大的抗氧化、调节血脂、抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞间隙连接通讯、增强机体免疫、调节环加氧酶新陈代谢等作用。

本试验成功建立了非酒精性脂肪肝模型,并在高脂膳食的同时应用番茄红素干预脂肪肝。结果显示,番茄红素能降低血清和肝组织中的脂质水平,减少FFA的生成,从而保护肝细胞;能明显抑制氧应激和脂质过氧化反应,促使氧化与抗氧化机制恢复平衡,从而使肝脏免受损害;能减轻高脂饮食诱导的肝细胞活动性损伤,从而起到保护肝细胞的作用;还可减轻肝脏的炎性损伤和脂肪变性程度,使肝细胞的结构和功能逐渐恢复正常。因此,番茄红素可认为同时兼有保肝和调脂的双重效应,其作用机制可能是:抑制自由基的生成和抗脂质过氧化;调节脂肪代谢,调节血脂水平,减少FFA的生成。

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