七味通痹口服液治疗类风湿性关节炎的机理研究

殷书梅，王 宓，林新艳，李吉峰 ，储益平

(1.江苏南星药业有限责任公司，江苏 南京 210046; 2.常州盛辉药业有限公司，江苏 常州 213000)

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以关节滑膜为主要靶组织的慢性系统性自身免疫性疾病。在RA自然病程中，5～10年致残率为60%，30年为90%。RA患者的平均寿命缩短10～15年，而伴关节外表现者的5年生存率仅为50%。因此，RA被看作和Ⅳ期淋巴瘤、冠状动脉病变有相似严重预后的疾病[1]。七味通痹口服液的前期实验研究表明，其能明显抑制弗氏完全佐剂所致大鼠致炎侧和对侧后肢(因迟发性超敏反应引起)的肿胀，降低大鼠前肢、耳部、尾部结节的发生率，降低大鼠血浆前列腺素E2、血清白细胞介素-1(IL-1)水平;组织病理学检查结果也表明，其能够减少大鼠踝关节腔内分泌物、关节软骨破坏、滑膜炎症和关节外软组织炎症的关节数。为了进一步探讨七味通痹口服液治疗RA的作用机理，笔者拟从抗炎和免疫两个方面观察，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

DK-8B型恒温浴槽(上海精宏实验设备有限公司);UV2401 PC型紫外-可见分光光度计(岛津制作所，P/N:206-82201-93);AR2140型电子分析天平(奥赛斯国际贸易〈上海〉有限公司)。七味通痹口服液(江苏南星药业有限责任公司，批号为070102);正清风痛宁(湖南正清制药集团股份有限公司，批号为0709112);2，4-二硝基氯苯(DNCB，南京玖泰化学试剂厂，批号为20010504);丙酮(上海化学试剂有限公司，批号为200608032)。ICR小鼠，SD大鼠，均由扬州大学比较医学中心提供，动物生产许可证为SCXK(苏)2007-0001。

1.2 方法

小鼠血清溶血素试验:取ICR小鼠60只，雌雄各半，体重18～22 g，随机分为6组，即正常对照组，左旋咪唑组，正清风痛宁组，七味通痹口服液低、中、高剂量组，每组10只。各给药组小鼠分别灌胃给予相应药物，正常对照组灌胃给予蒸馏水，灌胃容积均为10 mL/kg，每日1次，共10 d。给药第3天，对每只小鼠用20%绵羊红细胞(SRBC)腹腔注射0.2 mL致敏，末次灌胃给药后24 h，从小鼠眼眶取血0.5 mL，常规分离血清。于96孔微量血凝板上将血清作倍比稀释，每孔 50 μL，再于每孔中加入 50 μL 1%SRBC，混匀，置 37 ℃烘箱中3 h，观察红细胞凝集程度[2-3]，计算各组小鼠的血清抗体积数。再取ICR小鼠60只，操作同上，在致敏后的第4天和第6天每只小鼠腹腔注射环磷酰胺(CTX)30 mg/kg(正常对照组小鼠除外)。计算各组小鼠的血清抗体积数。抗体积数=(S1+2S2+3S3+……+n Sn)，式中1，2，3……n代表倍比稀释的指数，S表示凝集程度的级别，抗体积数越大，表示血清中抗体水平越高。0级为红细胞全部下沉，集中在孔底部形成致密的圆点状，四周液体清晰;Ⅰ级为红细胞大部分下沉在孔底成圆点状，四周有少量凝集的红细胞;Ⅱ级为凝集的红细胞在孔底形成薄层，中心可以明显见到1个疏松的红点;Ⅲ级为凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层，中心隐约可见1个小红点;Ⅳ级为凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层，凝块有时成卷折状。

小鼠迟发性超敏(DTH)反应试验:取ICR小鼠50只，体重18～22 g，雌雄各半，随机分为5组，即模型组，正清风痛宁组，七味通痹口服液低、中、高剂量组，每组10只。各组分别给予7%的DNCB丙酮溶液0.02 mL/只背部皮下注射致敏。给药组按20 mL/kg每日灌胃给药1次，连续10 d。末次灌胃给药后30 min，小鼠右耳涂以1%DNCB麻油溶液0.03 mL激发。24 h后处死动物，剪下左右两耳，用打孔器(直径9 mm)分别在同一部位取下圆耳片，电子天平称重，计算小鼠耳廓肿胀度(小鼠右耳廓重与左耳廓重的差值)，并计算肿胀百分率(肿胀度/左耳重)。再取ICR小鼠60只，操作同上，在致敏期间并不给药，仅在激发后1 h和13 h时灌胃给药2次，计算小鼠耳廓肿胀度，并计算肿胀百分率[4-6]。

小鼠印度墨汁巨噬细胞吞噬试验:取ICR小鼠60只，雌雄各半，体重18～22 g，随机分为6组，即正常对照组，左旋咪唑组，正清风痛宁组，七味通痹口服液低、中、高剂量组，每组10只。除正常对照组外，其余各组小鼠分别灌胃给予受试药物，每日1次，共10 d。末次给药后30 min，按每10 g体重0.1 mL尾静脉注射20%印度墨汁，注射后2，10 min用吸管(预先用肝素溶液润湿)分别从眶后静脉丛取血20 μL，溶于2 mL 0.1%Na2CO3溶液中，摇匀，置分光光度计，于650 nm波长下比色，测定吸光度(A)。将小鼠脱颈椎处死，分别称取肝、脾质量，计算炭粒廓清指数(K)和吞噬指数(a)[7-8]。

K=(log OD2min-logOD10min)/(t10-t2)

a=体重(g)×K1/3/肝脾质量(g)

大鼠纽扣肉芽肿试验:取雄性SD大鼠60只，体重150～180 g，随机分为6组，即模型组，阿司匹林组，正清风痛宁组，七味通痹口服液低、中、高剂量组，每组10只。以4%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉，仰卧位固定大鼠，腹部去毛，用碘酒和酒精消毒后，腹部正中切开，向两侧腹股沟做一隧道，将两枚纽扣(浸泡在75%乙醇中消毒)分别放入两侧腹股沟处，缝合切口。切口常规消毒，整个手术过程注意无菌操作。除模型组外，其余各组大鼠分别给予受试药物，每日1次，共10 d。于末次给药后24 h，处死大鼠，取出肉芽组织，称取肉芽组织的湿重;然后将肉芽组织放入80℃烘箱中烘24 h，取出，称取肉芽组织干重。比较各组间的差异，并计算抑制率[9-10]。

抑制率(%)=(对照组肉芽干重-给药组肉芽干重)/对照组肉芽干重×100%。

去肾上腺大鼠足趾肿胀试验:取雄性SD大鼠70只，体重130～150 g，乙醚浅麻醉后，摘除双侧肾上腺，术后喂饲糖盐水。手术后第3天将挑选手术成功大鼠60只，随机分为6组，即模型组，阿司匹林组，正清风痛宁组，七味通痹口服液低、中、高剂量组，每组10只。另取10只大鼠，不切除肾上腺，给予七味通痹口服液中剂量，作为七味通痹对照组。除模型组外，其余各组大鼠分别给予相应受试药物，每日1次，共5 d。末次给药后1 h，将大鼠后肢拉直，用26号针头先自足趾中部皮下向上注入一部分致炎剂(1%角叉菜胶0.1 mL)，然后调转针头向下注射完，分别于注射致炎剂前及注射后1，2，4，6 h时用测厚仪测定大鼠足趾的厚度，比较各组间的差异[9，11]。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 小鼠血清溶血素试验

结果见表1。对于免疫正常的小鼠，各剂量的七味通痹口服液均可降低小鼠血清抗体积数，其中中、高剂量组小鼠血清抗体积数显著低于正常对照组(P＜0.05或 P＜0.01)，其表现出了一定的体液免疫抑制作用。但是，当预先腹腔注射CTX导致小鼠免疫功能低下时，各剂量的七味通痹口服液又具有一定的升高血清溶血素作用，其中高剂量组小鼠血清抗体积数显著高于正常对照组(P＜0.05)，表明其对免疫低下小鼠具有一定的体液免疫增强作用。

表1 七味通痹口服液对小鼠血清溶血素的影响(，n=10)

表1 七味通痹口服液对小鼠血清溶血素的影响(，n=10)

注:与正常对照组相比，△P＜0.05，▲P＜0.01(表 3同)。

组别 剂量(g/kg)抗体积数正常对照组左旋咪唑组正清风痛宁组七味通痹组低-中高0.10.0471428正常小鼠133.8±55.5183.0±38.6△91.8±27.5△112.7±33.091.3±30.1△73.5±21.7▲免疫低下小鼠47.2±22.1107.3±27.8▲39.5±25.262.7±34.167.5±28.772.3±28.8△

2.2 小鼠迟发性超敏反应试验

结果见表2。致敏后给药(第1天至第10天)，七味通痹口服液对DNCB诱导的迟发性超敏反应具有显著的抑制作用，与模型组相比具有统计学意义(P＜0.05或 P＜0.01);但在激发后给药两次(第10天和第11天)，七味通痹口服液却不能对抗由DNCB诱导的迟发性超敏反应。

2.3 小鼠印度墨汁巨噬细胞吞噬试验

结果见表3。中、高剂量七味通痹口服液可升高小鼠炭粒廓清指数(K)和矫正廓清指数(a)，与模型组相比具有统计学意义(P＜0.05)，表明七味通痹口服液具有一定的非特异性免疫增强作用。

表2 七味通痹口服液对小鼠迟发性超敏反应的影响(，n=10)

表2 七味通痹口服液对小鼠迟发性超敏反应的影响(，n=10)

注:与模型组相比，□ P ＜0.05，■ P ＜0.01(表 4-6同)。

组别 剂量(g/kg)耳廓肿胀度(g) 肿胀抑制率(%)模型组正清风痛宁组七味通痹组低-中 高0.0471428激发前给药3.05±1.060.86±0.48■1.51±1.07■0.69±0.29■0.56±0.43■激发后给药3.27±1.962.74±1.473.51±2.143.30±1.933.07±1.78激发前给药19.47±7.365.50±2.66■10.20±8.32□4.45±1.91■3.70±3.32■激发后给药21.78±14.6618.12±10.1723.14±15.8221.89±13.92320.33±12.82

表3 小鼠印度墨汁巨噬细胞吞噬试验结果(，n=10)

表3 小鼠印度墨汁巨噬细胞吞噬试验结果(，n=10)

组别正常对照组左旋咪唑组正清风痛宁组七味通痹组低中高剂量(g/kg)-0.10.0471428炭粒廓清指数(K)0.050±0.0180.108±0.0470.056±0.0440.059±0.0200.082±0.040△0.080±0.031△吞噬指数(a)7.755±1.3739.986±2.0147.730±0.9518.820±1.9429.211±1.9399.270±1.127△

2.4 大鼠纽扣肉芽肿试验

结果见表4。各剂量七味通痹口服液均可降低肉芽组织的湿重和干重，与模型组相比具有统计学意义(P＜0.05或 P＜0.01)。

表4 七味通痹口服液对纽扣肉芽肿的影响(，n=10)

表4 七味通痹口服液对纽扣肉芽肿的影响(，n=10)

组别模型组阿司匹林组正清风痛宁组七味通痹组低中 高剂量(g/kg)-0.150.0471428湿重(mg)815.2±286.1364.3±76.2■511.2±162.2■477.3±88.8■464.1±234.6■426.3±113.3■干重(mg)251.4±63.1154.0±60.9■196.0±27.6□186.9±40.9□186.4±64.7□178.9±35.1□干重抑制率(%)-38.722.025.725.828.8

2.5 去肾上腺大鼠足趾肿胀试验

结果见表5、表6。对于未去肾上腺的大鼠，七味通痹口服液对角叉菜胶诱发的大鼠足趾肿胀具有较强的抑制作用;对于去肾上腺大鼠，七味通痹口服液对角叉菜胶诱发的大鼠足趾肿胀仍有一定的抑制作用，但作用强度有所降低。

表5 七味通痹口服液对大鼠足趾厚度的影响(mm，，n=10)

表5 七味通痹口服液对大鼠足趾厚度的影响(mm，，n=10)

组别 注射前剂量(g/kg)注射后模型组阿司匹林组正清风痛宁组七味通痹组低-中 高对照组0.150.0471428145.15±0.285.11±0.225.12±0.165.07±0.215.10±0.145.11±0.264.99±0.241 h 5.58±0.195.54±0.205.73±0.315.44±0.125.56±0.315.57±0.395.21±0.21■2 h 5.83±0.255.49±0.24■5.62±0.245.57±0.345.63±0.265.61±0.235.45±0.32■4 h 6.36±0.275.86±0.41■6.16±0.306.01±0.37□5.98±0.35□5.86±0.22■5.58±0.44■6 h 6.49±0.256.02±0.21■6.31±0.196.22±0.456.22±0.18□6.18±0.27□5.69±0.44■8 h 6.53±0.176.00±0.31■6.31±0.316.14±0.55□6.27±0.26□6.24±0.20■5.74±0.46■

表6 七味通痹口服液对大鼠足趾肿胀抑制率的影响(%，，n=10)

表6 七味通痹口服液对大鼠足趾肿胀抑制率的影响(%，，n=10)

组别 剂量(g/kg)注射后模型组阿司匹林组正清风痛宁组七味通痹组低-中 高对照组0.150.0471428141 h 8.66±5.038.48±6.5212.04±7.457.49±4.728.99±5.909.07±5.054.34±1.68□2 h 13.50±4.857.56±5.42□10.04±6.6310.04±7.4510.49±5.0010.07±4.499.11±2.89□4 h 23.92±8.1414.71±9.80□20.45±7.3018.71±6.2317.19±5.53□15.02±7.09□11.66±5.25■6 h 26.52±9.5817.96±7.03□23.39±5.4922.83±9.2522.12±5.1421.17±7.0213.76±4.99■8 h 27.33±8.0617.51±7.59□23.45±7.7721.32±10.9723.02±5.9022.44±7.7214.82±5.31■

3 讨论

20世纪80年代，对细胞因子的研究使得T细胞介导的免疫反应成为RA发病机制的中心环节，而且针对T细胞及其相关细胞因子的治疗取得了一定成效。RA患者滑膜组织浸润的T细胞多为CD4+和 CD45RO+记忆型细胞，具有 α， βTCR，表达 HLA-DR，CD69，VLA-1(很晚出现的抗原-1)及辅助刺激分子CD28，且A型滑膜细胞(Mφ型)表达HLA-DR、辅助刺激分子CD80(B7)及CD86(B70)。滑膜组织的T细胞接受抗原刺激而活化[12]。吴福国等[13]研究发现，RA患者外周血CD4+细胞与正常人比较无明显变化，而CD8+细胞明显减少，活化T细胞明显升高，表明细胞免疫处于亢进状态。T细胞处于激活状态，对RA病理的持续发展起重要作用[14]。迟发性超敏(DTH)是由T细胞介导的免疫反应，以此可观察药物对机体细胞免疫的影响。在动物实验中，首先用特定的抗原致敏动物，等一段时间后再次给予相同的抗原激发，再测定激发部位皮肤的厚度等来观察迟发性超敏的发生[4]。七味通痹口服液在致敏后开始给药，激发后停止给药，对迟发性超敏具有显著的抑制作用;在致敏后不给药，在激发后给药两次，抑制作用消失。这提示七味通痹口服液对机体中抗原的提呈以及效应T细胞和记忆T细胞的形成具有抑制作用，而对效应T细胞再次接触抗原后引起的炎症反应以及细胞毒作用无明显作用。

RA患者体内存在大量的自身抗体，与抗原结合后形成的免疫复合物在RA滑膜炎症及关节外表现中起到了重要作用。另外，在对RA滑膜的病理研究中发现，滑膜中存在B细胞滤泡和生发中心形成以及大量浆细胞浸润，说明B细胞参与了滑膜炎症的形成。有研究表明，RA患者血清免疫球蛋白(IgA，IgG，IgM)、补体C3水平显著高于正常对照组，提示RA患者体液免疫功能也处于亢进状态[15-16]。由本研究结果可知，七味通痹口服液具有一定的免疫增强作用和非特异性免疫增强作用，表明其对免疫系统具有双向调节作用。考虑到改变病情药物(DMARD)和一些单抗类药物常会导致机体免疫系统的过分被抑制，使机体出现感染等副作用，若同时使用七味通痹口服液，利用其对免疫的双向调节作用，有望显著减轻这些副作用。另外，本研究结果还表明，七味通痹口服液的抗炎作用与垂体-肾上腺轴有关，但并不完全依赖于垂体-肾上腺轴。

七味通痹口服液对免疫系统的双向调节作用以及抗炎作用，可能是其治疗RA的作用机制之一。近期研究表明，辅助性T细胞(help T cell，Th)亚群1和亚群2(Th1/Th2)细胞及其分泌细胞因子的水平失衡与RA的发生密切相关[17]。因此，七味通痹口服液对辅助性T细胞的影响及其对免疫系统作用的机理等还有待进一步研究。

[1]陈灏珠.实用内科学[M].第12版.北京:人民卫生出版社，2005:2556.

[2]曾春晖，杨 柯，王 燕.广西藤茶提取物APS对免疫功能的影响[J].中成药，2007，29(7):976-978.

[3]张仲苗，江 波，章荣华，等.人参皂苷Rg3对小鼠免疫功能的影响[J].中药药理与临床，2004，20(6):4-6.

[4]Borel JF.Pharmacology of Cyclosporine(Sandimmune)Ⅳ.Pharmaco-logical Properties in Vivo[J].Pharmacol Rev，1989，41(3):259-371.

[5]马 骏，任 远，王志旺，等.复方红芪颗粒剂主要药效学研究[J].中成药，2005，27(8):932-935.

[6]潘经媛，邱银生，严汉池，等.盐酸多塞平乳膏的止痒和抗过敏作用[J].中国药理学通报，2005，21(12):1505-1508.

[7]李仪奎.中药药理实验方法学[M].上海:上海科学技术出版社，1991:155，298.

[8]王佳平，任 雁，吴英良，等.百多宁乳剂对荷S180肉瘤小鼠免疫功能的影响[J].沈阳药科大学学报，2007，24(7):421-425.

[9]徐叔云，卞如濂，陈 修.药理实验方法学[M].第3版.北京:人民卫生出版社，2003:919，91，929.

[10]严道南，卞慧敏，耿晓文，等.开音颗粒对大鼠实验性慢性肉芽肿的影响[J]. 辽宁中医杂志，2005，32(9):890.

[11]韩召敏，华小黎，吕永宁，等.拔葜抗炎作用及对炎症介质的影响[J].中华中医药学刊，2008，26(2):295-297.

[12]费克乡，雷元卫.类风湿性关节炎免疫功能异常的研究进展[J].国外医学·免疫学分册，1999，22(6):323-326.

[13]吴福国，刘玉庆，张向阳，等.类风湿性关节炎患者外周血T淋巴细胞亚群分析[J].济宁医学院学报，1999，22(1):27-29.

[14]蒋 明，朱立平，林孝义.风湿病学[M].北京:科学出版社，1996:98-123.

[15]邹 刚，卫海荣.类风湿性关节炎患者血清免疫球蛋白和补体水平的检测与分析[J].中原医刊，2006，33(11):82-83.

[16]Eberhardt KB，Truedsson L，Pettersson H，et al.Disease activity and joint damage progression in early rheumatoid arthritis:relation to IgG，IgA，and IgM rheumatoid factor[J].Ann Rheum Dis， 1990， 49:906-909.

[17]Okamoto Y，Nishida M.Cytokine balance in the pathogenesis of rheumatoid arthritis[J].Yakugaku Zasshi， 2001(2):131.