尼泊尔酸模α-葡萄糖苷酶抑制活性及抗菌活性研究

康文艺， 刘瑜新， 宋艳丽， 张 丽

(河南大学中药研究所，河南开封475004)

尼泊尔酸模(Rumex nepalensis Spreng.)为蓼科酸模属植物，分布于河南、陕西、甘肃、青海、湖北、四川、云南和西藏等省。全草入药，有清热解毒、凉血止血之效［1］。尼泊尔酸模干燥根是贵州土大黄的植物来源［2］。文献研究表明，尼泊尔酸模的研究报道很少，未见其化学成分研究报道。药理研究表明，尼泊尔酸模根含活性蛋白-凝集素，能使3%兔红血球发生凝集反应［3］。Ghosh L.等在2002年和2003年连续报道了尼泊尔酸模根甲醇提取物具有泻下和镇静作用［4-5］。

本文利用体外筛选模型对尼泊尔酸模根和地上部分的提取物进行了α-葡萄糖苷酶抑制活性和抗菌活性研究，以期为尼泊尔酸模开发利用提供科学依据。

1 仪器与材料

Multiskan MK3酶标仪(美国Thermo Electron公司);LRH-150恒温培养箱(上海一恒科技有限公司);DELTA 320型PH计(美国Mettler-Toledo公司);LRH-150生化培养箱(上海一恒科学仪器有限公司);LDZX-30KB立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)。

α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase，EC 3.2.1.20);4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷 (4-N-trophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG，026K1516);阿卡波糖(Acarbose，Lot 16869)和二甲亚砜(DMSO)均购自美国 Sigma公司。金黄色葡萄球菌(Staphlococcus aureus，SA)ATCC25923购买于上海天呈生物信息有限公司(批号TC-26)，耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(Methcillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)和 ESBLs由河南大学附属淮河医院临床分离得到，经全自动微生物分析仪VITEK-AMS鉴定，符合率99%。

尼泊尔酸模样品于2007年11月采于河南省开封地区，经河南大学中药研究所生药教研室李昌勤副教授鉴定为蓼科酸模属植物尼泊尔酸模(R.nepalensis Spreng)。

2 实验部分

2.1 提取

干燥的尼泊尔酸模根和地上部分粉碎，称取30 g，石油醚浸泡12 h后，于索氏提取器中连续回流提取3次，每次1 h，得根石油醚提取物(RNRP)和地上部分石油醚提取物(RNAP)。挥干溶剂后，按上面的方法用乙酸乙酯提取，得尼泊尔酸模根乙酸乙酯提取物(RNRE)和地上部分提取物(RNAE)。挥干溶剂后，同样方法甲醇提取，得甲醇提取物(RNRM和RNAM)。尼泊尔酸模不同溶剂提取物的得率见表1。

2.2 α-葡萄糖苷酶抑制活性的筛选方法

以本课题建立的96微孔板筛选方法，405 nm处检测其OD 值［6-8］。

尼泊尔酸模对α-葡萄糖苷酶抑制的动力学实验

按照文献［7］，分别加入不同浓度的底物(分别为10，5，2.5，1.25 mmol/L 和0.625 mmol/L)按照上述方法测定不同底物浓度下的反应速度。同时测定不加抑制剂时不同底物浓度的反应速度，分别绘制提取物的抑制作用动力学曲线，确定抑制类型。

表1 尼泊尔酸模的α-葡萄糖苷酶抑制活性(n=3)

2.3 抗菌实验方法

2.3.1 抑菌圈的测定

按照文献［9］的方法，用微量加样器分别取5 μL样品加到直径6 mm的圆形滤纸片上，挥干溶剂后，置于含菌平板，同时用溶剂做空白对照。37℃恒温培养24 h，观察结果，记录抑菌圈的大小。每份样品平行操作3次，结果取平均值。所有操作均在无菌条件下进行。

2.3.2 最低抑菌浓度(MIC)的测定

将出现抑菌圈的样品进行对半稀释，按2.3.1项操作进行，每个浓度平行操作3次，取平均值。用相应溶剂作空白对照;出现抑菌圈的最低样品浓度即为MIC值。所有操作均在无菌条件下进行。

3 结果与讨论

3.1 各提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性

对尼泊尔酸模根和地上部分的石油醚、乙酸乙酯和甲醇部分在相同浓度下(1.5 mg/mL)测定其α-葡萄糖苷酶的抑制活性(表1)。从表1可以看出尼泊尔酸模根和地上部分在浓度为1.5 mg/mL时各提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性均较高(抑制率接近100%)，且均高于阳性对照药阿卡波糖(68.43%)，表明尼泊尔酸模具有较好的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

为进一步研究抑制活性，对尼泊尔酸模各提取物的初筛终浓度依次对半稀释进行IC50值计算(表1)。从表1可以看出，各提取物的 IC50值大小为:RNAE(2.13 μg/mL)、RNAM(2.13 μg/mL)、RNRE(3.83 μg/mL)、RNRM(22.5 μg/mL)、RNRP(36.01 μg/mL)和 RNAP(56.59 μg/mL)，远低于阳性对照 Acarbose(1081.27 μg/mL)。

不同溶剂比较，尼泊尔酸模的乙酸乙酯提取物的IC50值最小，显示其抑制效果最好，其次为甲醇提取物，石油醚提取物的IC50值最大;不同部位比较，尼泊尔酸模地上部分的乙酸乙酯提取物抑制活性(IC50=2.13 μg/mL)和甲醇提取物抑制活性(IC50=2.13 μg/mL)较其根的同溶剂提取物抑制活性(IC50=23.83 μg/mL 和 22.50 μg/mL)高，但其石油醚提取物抑制活性(IC50=56.59 μg/mL)较根(IC50=36.01 μg/mL)的弱。说明尼泊尔酸模的地上部分是其主要的药用部位。

3.2 提取物浓度对α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响

结果还显示，尼泊尔酸模不同部位不同溶剂的提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性均呈剂量依赖性，其中地上部分石油醚提取物在终浓度小于0.2 mg/mL时达到最大抑制率100%，此后再增加提取物浓度抑制率不再变化，其他提取物在终浓度小于0.1 mg/mL时，其抑制率就达到了最大值100%，此后，再增加提取物浓度抑制率也不再变化。

3.3 酶抑制动力学［10］

通过绘制抑制剂的Lineweave-Burk双倒数曲线(如图1)，得到不加抑制剂时的α-葡萄糖糖苷酶的线性方程:y=14.218x+4.6123，求得其 Km=3.08 mmol/L，1/Vmax=4.6123。

根据文献，由图1可知尼泊尔酸模地上部分的乙酸乙酯提取物的抑制类型为非竞争性抑制类型，反应速度Vmax随着抑制剂浓度的增大而变小，米氏常数Km保持不变。并根据非竞争性抑制动力学方程:1/V′max=1/Vmax(1+［I］/Ki)，求得尼泊尔酸模地上部分乙酸乙酯提取物浓度为2.93 mg/mL时，1/V′max=21.854，Ki=0.7837 μg/mL;浓度为1.46 mg/mL时，1/V′max=8.4754，Ki=0.7945 μg/mL。抑制剂浓度越大，Ki值越小，抑制愈强。而其甲醇部分则属于混合型抑制类型，当其浓度为 2.93 mg/mL 时，1/V′max=63.539，Km=0.888 μg/mL，当其浓度为浓度为 1.46 mg/mL 时，1/V′max=11.4600，Km=1.6636 μg/mL，反应速度 Vmax随着抑制剂浓度的增大而变小，米氏常数Km也随抑制剂浓度的增大而降低。

图1 尼泊尔酸模地上部分乙酸乙酯提取物与甲醇提取物的Lineweave-Burk双倒数曲线

3.4 抗菌活性

研究尼泊尔酸模根和地上部分不同提取部位对金黄色葡萄球菌(SA)、耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)和β-内酰胺酶阳性的金黄色葡萄球菌(ESBLs)的抑菌活性，结果显示:其地上部分抑菌活性不明显，根具有较好的抑菌活性(表2和表3)。

表2 尼泊尔酸模根提取物对各受试菌种的抑菌圈(样品浓度均为0.25 mg/disc)

表3 尼泊尔酸模根提取物对受试菌种的MIC(mg/disc)

4 结论

实验结果表明，尼泊尔酸模根和地上部分的乙酸乙酯提取物具有较高的α-葡萄糖苷酶抑制活性;尼泊尔酸模地上部分的乙酸乙酯部分的抑制类型为非竞争性抑制，其甲醇部分为混合型抑制。尼泊尔酸模根的抑菌活性较好，其活性部位为石油醚部位和乙酸乙酯部位。

［1］丁宝章.河南植物志［M］.开封:河南人民出版社，1981:322.

［2］王世清，万明香.贵州土大黄的品种鉴定研究［J］.中国药业，2005，14(1):33-34.

［3］王 莉，旺 姆，桑 姆.尼泊尔酸模根中活性蛋白—凝集素特性初探［J］.中国野生植物资源，2004，23(4):48-49.

［4］Ghosh L，Arunachalam G，Murugesan T，et al.Studies on the psychopharmacological activities of Rumex nepalensis Spreng.root extract in rats and mice［J］.Phytomedicine，2002，9:202-206.

［5］Ghosh L，Gayen J R，Murugesan T，et al.Evaluation of purgative activity of roots of Rumex nepalensis［J］.Fitoterapia，2003，74:372-374.

［6］康文艺，张 旭，刘瑜新.何首乌对α-糖苷酶的抑制作用［J］.精细化工，2009，26(10):965-967.

［7］康文艺，张 丽，宋艳丽.茜草抑制α-葡萄糖苷酶活性成分研究［J］.中国中药杂志，2009，34(9):1104-1107.

［8］康文艺，贺光东，李晓梅，等.卷柏酸性成分提取工艺及活性研究［J］.精细化工，2008，25(12):53-57.

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