腹腔植入化疗对大鼠结肠吻合口愈合影响的实验研究

杨广令,张俊华*,张银旭,周晓敏

(1辽宁医学院第一附属医院,辽宁锦州 121000;2辽宁医学院)

结直肠癌根治术后 5 a复发率高达 50%,如何 防治结直肠癌术后局部复发及肝脏转移是提高其临床疗效的关键所在[1]。氟尿嘧啶(Fu)植入剂(中人氟安)是一种新型的缓释型化疗药物,能够在给药区域较长时间维持较高的、稳定的药物浓度,有利于杀死没有切除的亚临床病灶、微小转移灶及腹腔内的游离癌细胞,但是在杀死肿瘤细胞的同时会不会对机体产生不良影响尚缺乏一定的基础研究。2009年 5～6月我们通过建立大鼠结肠吻合口模型以探讨腹腔植入中人氟安对大鼠全身及吻合口愈合的影响,为临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 成年雄性大鼠 60只,体质量 200～250 g,由辽宁医学院实验动物中心提供。

1.2 主要试剂和器械 5-氟尿嘧啶(5-Fu)注射液,Fu植入剂,考马斯亮兰蛋白测定试剂盒和羟脯氨酸测试盒(消化法)(南京建成生物工程研究所),抗Ⅰ、Ⅲ胶原纤维抗体(北京博奥森生物技术有限公司),KT 6180全自动血液细胞分析仪,全自动生化仪,菁华 754紫外可见分光光度计,CH-20光学显微镜。

1.3 动物模型制备、分组与处理 大鼠术前禁食12 h,术后自由饮水、12 h后少量进食。2%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉后腹部消毒,在剑突下 1 cm处取长约 3 cm腹正中切口切除约 1 cm结肠,吻合肠管后逐层关腹。术毕将 60只大鼠随机分为 A、B、C 3组,每组 20只,组内再随机分为两个亚组各 10只。A组:术后 24 h腹腔注射生理盐水(NS)20m l/(kg◦ d),连用 5 d;B组:腹腔注射 5-Fu 20 ml/(kg◦ d)+NS 20m l/(kg◦ d),连用 5 d;C组:术中在距吻合口约 1 cm外的浆膜层和肠系膜一次性植入中人氟安 20 mg/kg,其中第 1亚组 2只大鼠肠壁上分别固定 3和 6粒中人氟安(约占总药量的 33%和 50%),第 2亚组 1只在距吻合口约 0.7 cm、另 1只在大鼠肠系膜中供应吻合口的血管旁分别固定 5粒中人氟安。A、B、C组均在术后第 7天处死第 1亚组,第 14天处死第 2亚组。

1.4 观察指标

1.4.1 一般状况 观察各组大鼠的饮食情况、活动、反应、精神状态和腹部切口愈合情况等,治疗期间对死亡大鼠进行解剖以明确死亡原因。于术后第7天剖腹后观察腹腔和吻合口的大体形态,并根据van der Ham等[2]方法进行评分:0分:无粘连;1分:轻度粘连(主要在吻合口和网膜之间);2分:中度粘连(吻合口和小肠之间,吻合口两侧与网膜粘连);3分:重度粘连(吻合口周围形成脓肿)。

1.4.2 血常规(Rt)及肝、肾功能指标 术后第 7天和第 14天处死大鼠的同时抽下腔静脉血 5 ml,测试 Rt和肝、肾功能。

1.4.3 吻合口破裂压(ABP) 剖腹后在距吻合口两端各 3 cm处结扎肠袢,肠袢一端与微量输液泵连接,另一端通过压力换能器连接电脑,通过 LMS-2B型二道生理记录仪描记压力曲线。输液泵以 2m l/min速度向肠管内注入亚甲蓝溶液,观察到压力曲线突然下降时即 ABP。

1.4.4 羟脯氨酸(HYP)测定 以吻合口为中心切取长 0.5 cm的肠壁,除净粘连的组织后称取湿重为40～100mg的组织放入 EP管中,彻底粉碎后分别按考马斯亮兰蛋白测定试剂盒和 HYP试剂盒说明进行操作。

1.4.5 病理组织学检查 吻合口组织常规石蜡包埋、切片,做免疫组织化学染色后显微镜观察并做图像分析,结果取像素和面积平均后的乘积。

1.5 统计学方法 采用 SPSS 13.0统计软件进行数据分析处理。所有数据以±s表示,多个样本间总体率的比较用 χ2检验,多个样本均数间两两比较用最小有意义差异法(LSD法)。以 P≤0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 一般情况 3组动物术后 12 h后恢复进食,大鼠活动力均恢复正常,对外界刺激反应略迟钝,精神可。A组无死亡;B组两个亚组分别发生吻合口漏 4只,死亡 8只;C组第 1亚组发生肠穿孔 2只,第 2亚组发生吻合口漏 2只,死亡 4只。各组间死亡率比较有统计学差异(P＜0.05)。术后第 7天 A、B、C组吻合口评分分别为 3、12、5分,B组高于 A、C组(P＜0.05)。

2.2 Rt及肝、肾功能 术后各组间 Rt结果比较见表 1。术后第 7天各组间血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)等比较均无统计学差异(P＞0.05)。

表1 三组术后大鼠 Rt结果比较(×109/L,±s)

表1 三组术后大鼠 Rt结果比较(×109/L,±s)

注:与A组比较,*P＜0.05;与 C组比较,△P＜0.05

组别 WBC第 7天 第 14天RBC第 7天 第 14天PLT第 7天 第 14天A组 3.84±0.60△ 1.35±0.23△ 2.46±0.19 2.45±0.24 154.80±86.00 149.30±69.84 B组 0.82±0.29*△ 7.90±3.28*△ 1.64±0.66*△ 2.42±0.31 56.17±42.51*△ 148.50±61.59 C组 6.65±3.14* 3.21±0.32* 2.25±0.12 2.41±0.16 157.88±86.92 149.38±54.06

2.3 ABP和 HYP 术后三组 ABP和 HYP水平比较见表 2。

表2 三组术后 ABP和 HYP水平比较(±s)

表2 三组术后 ABP和 HYP水平比较(±s)

注:与 B组比较,*P＜0.01

组别 ABP(mmHg)第 7天 第 14天HYP(μg/mgprot)第 7天 第 14天A组 129.86±2.78*135.72±0.63 3.45±0.40*4.14±0.30 B组 80.37±25.29 130.90±1.60 2.88±0.36 3.82±0.29 C组 124.48±4.81*132.33±6.54 3.32±0.40*3.98±0.24

2.4 病理组织学 术后第 7天吻合口有增生的毛细血管和大量呈梭形的成纤维细胞,组织较疏松,并可见炎细胞浸润;术后第 14天吻合口由大量胶原纤维组成,血管及细胞成分较术后第 7天减少,组织较致密,可见瘢痕表面有腺体细胞生成。Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维呈棕黄色颗粒状或片状,显色均在细胞质和胶原特定的区域,各组Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维含量比较见表 3。

表3 三组术后Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维含量比较(±s)

表3 三组术后Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维含量比较(±s)

注:与 A组比较,*P＜0.01;与 B组比较,△P＜0.01

组别 Ⅰ型胶原纤维第 7天 第 14天Ⅲ型胶原纤维第 7天 第 14天A组 1.68±0.10 2.60±0.26 1.48±0.11 2.31±0.19 B组 1.18±0.11*2.54±0.19*1.16±0.10*2.24±0.16*C组 1.53±0.08△ 2.57±0.23△ 1.44±0.09△ 2.28±0.17△

3 讨论

多数实验研究认为术后早期腹腔化疗干扰伤口的正常愈合[3]。肠吻合口愈合时,结合力的强度主要依赖于黏膜下层的胶原纤维量[4],其中HYP在胶原中的含量较为稳定,约占胶原氨基酸总量的 14%,是胶原纤维的特征性氨基酸,通过对创面 HYP含量的测定可了解创面胶原合成及转运情况。而 ABP则为肠内压上升致使吻合口破裂时的压力,直接反映吻合口的抗张强度。肠吻合口愈合强度取决于胶原纤维合成与降解的平衡,肠吻合口愈合需要不同时间点的动态观察,单一时间点的测定结果可能得出相左的实验结论[5]。

实验证实 5-Fu对消化道肿瘤有确切疗效,且5-Fu的疗效有明显的时间依赖性即作用时间越长疗效越好。中人氟安为 Fu的固体缓释植入剂,植药 10 d内血药浓度可持续 0.1μg/m l以上,克服了 5-Fu半衰期短和短时间内血液浓度高所导致的不良反应。鉴于此本实验选择两个时间点,利用5-Fu按照 Sugarbaker提出的术后 24 h起连续 5 d给药的早期腹腔化疗与 Fu植入剂术中植入化疗进行对比,以验证固体缓释植入剂的安全性。本实验根据实验动物与人的药物剂量换算方法[6],应用 5-Fu和 Fu植入剂均为 20 mg/(kg◦d)。治疗期间 B组发生吻合口漏 8例,均死亡,说明大剂量腹腔化疗使吻合口浸润在高药物浓度中,同时药物可以被腹膜很快吸收入血液,使血药浓度形成瞬时峰值,影响吻合口细胞生长,进而影响吻合口早期愈合。C组有 2例大鼠肠穿孔,肠壁单点植药量约占总药量的 33%和 50%,2例吻合口漏,说明 Fu植入剂植入不易距吻合口太近,同时单点植入不易过多,特别是大的血管旁和肠壁,以免引起溃疡而导致穿孔或血管破裂出血,同时在供应吻合口的血管旁亦不易植入过多,以防影响吻合口愈合。

术后第 7天 B组大鼠体质量略有减轻,剖腹后见 B组腹腔粘连较重,个别大鼠出现腹茧症[7],吻合口评分较高,说明大剂量 5-Fu腹腔化疗能在组织周围和血液里形成瞬时高的药物浓度,干扰结肠吻合口成纤维细胞及其他正常细胞的生成,故吻合口脆性较大、抗拉强度低、ABP和 HYP均很低,吻合口漏发生率增加。C组腹腔粘连较轻,对骨髓抑制及吻合口周围的成纤维细胞和其他正常细胞影响不明显,吻合口能抵抗一定拉力,ABP和 HYP与 A组相差不大。A、C组 WBC计数比较高,C组最高,说明 C组除结肠和腹壁吻合口中的线结和坏死组织细胞引起的炎症外,Fu植入剂药粒本身也会引起无菌性炎症,同时它也能使植药周围的细胞不断死亡,需要更多的 WBC清除。B组则因大剂量 5-Fu腹腔化疗引起骨髓抑制导致全血细胞减少。术后第 14天 B组 WBC计数最高,表明化疗药物结束后骨髓抑制状态解除,造血系统恢复造血,同时吻合口周围和造血系统有大量坏死组织、细胞和(或)不成熟细胞,加上线结引起的炎症,使 WBC增多,同时大剂量化疗药使腹腔粘连较重,部分结肠处于不完全梗阻状态,也是WBC增多的原因。C组较第 7天降低,说明吻合口部位所引起的炎症已经消退,且 Fu植入剂药力减弱,周围死亡细胞减少,为药粒形成的轻微炎症反应所致。除 WBC外,3组 RBC、PLT、ABP、HYP和Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维含量均高于术后第 7天,说明大剂量 5-Fu术后早期腹腔化疗影响结肠吻合口早期愈合,增加肠吻合口瘘发生率,但并不降低后期结肠吻合口的抗张力强度。而 Fu植入剂术后用于腹腔化疗并不影响结肠吻合口的早期愈合,不增加肠吻合口瘘的发生率,且不会引起肝、肾损害,为防治结直肠癌术后转移和复发提供了一种安全、可行的辅助化疗方法。

[1]张森,万德森,潘志忠,等.结直肠癌肝转移的多因素分析[J].中华肿瘤杂志,2002,24(4):367-369.

[2]van der Ham AC,KortWJ,Weijma IM,etal.Effect of antibiotics in fibrin sealant on healing colonic anastomoses in the rat[J].Br J Surg,1992,79(6):525-528.

[3]张卫,韩文妙,郁解非.结肠吻合口愈合的实验研究及其进展[J].国际外科学杂志,1990,2:88-91.

[4]Jönsson K,Jiborn H,Zederfeldt B.Collagen metabolism in small intestinal anastomosis[J].Am JSurg,1987,154(3):288-291.

[5]Makrin V,Lev-Chelouche D,Even SE,etal.Intraperitoneal heated chemotherapy affects healing ofexperimental colonic anastomosis:an animal study[J].JSurg Oncol,2005,89(1):18-22.

[6]施新遒.医用实验动物学[M].西安:陕西科学技术出版社,1989:429-432.

[7]王罡,张俊华,杨广令,等.原发性腹茧症致肠穿孔 1例分析[J].中国当代医药,2009,16(12):53-54.