P16和CDK4在乳房外Paget病中的表达及相关性分析

陈仁琼，周之海

（天津医科大学总医院皮肤科，天津 300052）

乳房外 Paget病 (extramammary Paget’s disease，EMPD)是一种少见的皮肤顶泌腺恶性肿瘤，在组织学上，表皮内出现特征性的Paget细胞，而且这种细胞也见于经典的乳房Paget病中[1-2]。越来越多的证据表明，细胞周期调控异常是肿瘤发生的一个重要机制。P16和细胞周期素依赖激酶4(CDK4)为两种细胞周期调节因子，它们均通过作用于G1期而调节细胞的增殖与分化。CDK4通过与细胞周期素D(cyclinD)结合而被激活，激发细胞从G1至S期的过渡，刺激细胞分裂、增殖，对细胞周期进行正调控；P16为细胞周期抑制因子，它可与CDK4结合，抑制CDK4活性，使细胞停滞于G1期而对细胞进行负性调控。本研究的目的是了解P16和CDK4在EMPD中的表达及其意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本 石蜡标本均来自天津医科大学总医院皮肤科2002～2008年门诊及住院的34例EMPD患者，平均年龄 67（47～87）岁，男 30 例，女 4 例。所有EMPD患者皮损标本均经苏木精-伊红染色和免疫组化染色确诊。正常对照为在天津医科大学总医院门诊整形外科行包皮环切术的健康男性共20名，平均年龄56（49～60）岁。其切除的包皮无皮肤病(如皮炎、真菌感染等)，其包皮组织经组织病理切片证实为正常皮肤组织。

1.1.2 试剂 鼠抗人P16单克隆抗体和二步法免疫组化检测试剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司，兔抗人CDK4多克隆抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化染色方法 所有标本均经10%甲醛固定，石蜡包埋，切片5 μm厚，分别行苏木精-伊红染色及免疫组化染色。免疫组化染色按免疫组化二步法检测试剂盒操作说明书进行操作。石蜡切片常规脱蜡至水；高温法修复抗原，3%H2O2用室温孵育10 min，滴加一抗，工作浓度为1∶50，37℃孵育90 min,加二抗工作液37℃孵育30 min，DAB显色，苏木精复染细胞核；脱水，透明，中性树胶封片，显微镜下观察并摄像。PBS代替一抗作为阴性对照。

1.2.2 结果判定 P16阳性染色为细胞核/浆着色，CDK4阳性染色为细胞核着色。结果判定标准参照Campo等[3]的标准，结合染色强度和染色百分率进行结果判定。染色强度评分标准为：基本不着色为0分，着色弱为1分，着色中度为2分，着色强为3分。染色百分率评分标准为：着色细胞占总细胞数<5%为0分，6%～25%为 1分，26%～50%为 2分，>50%为3分。以染色强度和染色百分率的评分之和进行结果判定：0分为阴性（-），1～2分为弱阳性(+),3～4分为阳性(++),≥5为强阳性(+++)。

1.3 统计学方法 采用SPSS软件进行统计学分析，并采用Spearman相关分析，P<0.05判为有统计学意义。

2 结果

2.1 P16在EMPD和正常皮肤组织中的表达 34例EMPD患者标本中有10例（29.4%）P16表达阳性，其中5例为弱阳性，5例中度阳性，阳性表达主要位于细胞核和细胞质（图1）；20例正常皮肤组织中P16表达均阴性（表1）。两者之间差异有统计学意义（χ2=5.402，P<0.05）。

2.2 CDK4在EMPD和正常皮肤组织中的表达 34例EMPD患者标本中有23例（67.6%）CDK4表达阳性，其中9例中度阳性，14例为强阳性，阳性表达主要位于细胞核（图2）；20例正常皮肤组织中仅有6例弱阳性表达（表1）。两者之间差异有统计学意义（χ2=5.744，P<0.05）。

2.3 P16和CDK4的表达与患者腹股沟淋巴结转移的关系 淋巴结转移阳性组中P16的阳性表达高于阴性组，但两者之间差异无统计学意义(χ2=0.024，P>0.05)。CDK4的阳性表达高于阴性组，两者之间差异有统计学意义（χ2=5.958，P<0.05），见表 2。

2.4 EMPD患者中P16和CDK4表达的相关性 23例CDK4阳性表达患者中P16阳性表达7例、阴性表达16例，11例CDK4阴性表达患者中P16阳性表达3例、阴性表达8例。Spearman相关分析发现，EMPD患者中P16表达与CDK4表达无相关关系。

图1 P16在EMPD中的阳性表达(DAB染色，A×100，B×400）

图2 CDK4在EMPD中的阳性表达(DAB染色，C×100，D×400）

表1 P16和CDK4在EMPD和正常皮肤组织中的表达

表2 P16和CDK4的表达与EMPD淋巴结转移间的关系

3 讨论

随着人们对细胞周期调控认识的不断深入，人们发现肿瘤实际上是一类细胞周期疾病，尤其是P16和CDK4组成的调控途径与肿瘤发生的关系更为引人瞩目。

P16是细胞周期蛋白依赖性抑制因子CKI的INK4家族成员，能特异性地抑制cyclin/CDK4(CDK6)的磷酸化激酶活性，阻止细胞从G1期进入S期[4]。目前在大部分肿瘤中发现P16有缺失或突变，但突变和缺失具有肿瘤类型的倾向性，在某些肿瘤中其突变和缺失较少见。但一些研究发现在HPV16/18感染以及pRb表达阴性的宫颈癌、肺癌、头-颈鳞状细胞癌中，p16不是表现为突变或缺失，而是过度表达[5]，推测通过诱导Rb蛋白降解而激活P16蛋白过度表达，这一推测同我们在EMPD中所检测的结果相符合。本研究结果表明34例EMPD中阳性表达率为 29.4%（10/34）,推测因 pRb失活，P16的反馈调节作用丧失，导致P16在EMPD组织呈弱阳性和中度阳性表达，与Santos等[6]报告一致。由于P16的表达增多并不能有效调控肿瘤细胞内不断增多E2F，故P16的高表达不能很好地抑制细胞增殖。正常细胞周期中P16含量在G0~G1期最低，基本不出现阳性染色，所以P16在正常组织中几乎不表达。这一观点与本文结果一致。本研究结果表明EMPD组织中P16和淋巴结转移无关，推测可能与样本量偏小和产生的癌蛋白含量低有关。

CDK4蛋白是CDKs蛋白家族中的重要一员，其含量及活化程度在细胞增殖周期卡点G1/S转换过程中起限速作用。Al-Aynati等[7]用免疫组化法检测了胰腺癌组织中CDK4蛋白的表达，发现其过表达的检出率为76%，而且恶性程度越高，其检出率也越高。本文结果显示CDK4表达水平EMPD中高于正常皮肤组织（P<0.05）。CDK4的表达水平与淋巴结转移显著相关(P<0.05)，有淋巴结转移的患者显示有较高的CDK4的表达率。以上研究表明，P16和CDK4表达异常与EMPD的发生发展密切相关，并且CDK4过表达多见于有淋巴结转移的肿瘤中，因此提示CDK4与EMPD，尤其与肿瘤的侵袭性和转移有一定的相关性。EMPD组织中P16和CDK4蛋白表达不相关，提示在EMPD的发生发展过程中可能各自是一个独立事件，更好地揭示了肿瘤发生发展的复杂机制，但也有可能与样本量偏小有关。

综上所述，EMPD组织中P16和CDK4表达明显高于正常对照组，提示P16和CDK4表达增加可能参与了EMPD中细胞增殖与调控的发病过程。还可以作为早期诊断、恶性程度判断、转移潜能判断及预后估价重要指标的依据之一，从而指导选择合理的治疗方案。二者在EMPD中的发病机制有待于更深入的研究。

［1］Ohnishi T,Watanabe S.The use of cytokeratins 7 and 20 in the diagnosis of primary and secondary extramammary Paget’s disease[J].Br J Dermatol,2000,142(2):243

［2］Lloyd J,Flanagan AM.Mammary and extramammary Paget’s disease[J].J Clin Pathol,2000,53(10):742

［3］Campo E,Merino MJ,Liotta L,et al.Distribution of the 72-kd type IV collagenase in nonneoplastic and neoplastic thyroid tissue[J].Hum Pathol,1992,23(12):1395

［4］Matsuda Y,Ichida T,Genda T,et al.Loss of p16 contributes to p27 sequestration by cyclinD1-cyclin-dependent kinase 4 complexes and poor prognosis in hepatocellular carcinoma[J].Clin Cancer Res,2003,9(9):3389

［5］Lari MA,Staebler A,Zaino RJ,et al.Distinction of endocervical and endometrial adenocarcinomas:immunohistochemical p16 expression correlated with human papillomavirus(HPV)DNA detection[J].Am J Surg Pathol,2004,28(2):160

［6］Santos M,Landolfi S,Olivella A,et al.p16 overexpression identifies HPV-positive vulvar squamous cell carcinomas[J].Am J Surg Pathol,2006,30(11):1347

［7］Al-Aynati MM,Radulovich N,Ho J,et al.Overexpression of G1-S cyclins and cyclin-dependent kinases during multistage human pancreatic duct cell carcinogenesis[J].Clin Cancer Res,2004,10(19):6598