乙型肝炎病毒1896位点变异荧光PCR法检测及意义

李秀梅 ，汤 华

（1.天津医科大学基础医学院,天津市生命科学中心实验室，天津300070；2.天津市传染病医院）

乙型肝炎病毒（HBV）的变异是较普遍的现象[1-2]。既往认为在HBV感染过程中，血清HBeAg的消失，抗－HBe的出现意味着病毒复制的停止与病变活动的缓解[3]。然而，近年来发现一些抗－HBe阳性但仍有HBV复制的活动性肝炎患者[4]。进一步研究发现这类肝炎患者体内存在一种HBV变异株。HBV前C区1896位的核苷酸由G变为A，导致28位密码子由色氨酸（TGG）变为终止密码子（TAG），由于该变异使病毒不能编码HBeAg，肝细胞表面靶抗原HBeAg消失，一方面使病毒发生免疫逃逸，使得HBV得以长期持续；另一方面HBeAg的消失还导致免疫耐受性的减退，因而诱发炎症活动[2，5]。这是HBV最常见的变异，具有重要临床意义。本文采用荧光PCR法检测HBV前C区1896位点突变，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

1.1.1 研究对象 2006年5月～2007年8月在传染病医院住院患者74例，男49例，女25例，年龄19～69岁。临床诊断按照2000年全国肝炎会议修订的标准，无症状乙肝病毒携带者（ASC）10例，急性乙型肝炎（AHB）5例，慢性乙型肝炎（CHB）43例，肝炎肝硬化活动期（LC）16例。上述病例血清无甲、丙、丁、戊肝炎病毒标志物（ELISA法），且PCR检查HBV DNA阳性。

1.1.2 试剂 血清标志物检测所用试剂为华美公司产品。HBV DNA定量检测所用试剂为广州达安公司产品。荧光PCR法检测1896位点变异试剂为杭州博赛基因诊断技术有限公司产品：包括核酸提取液；HBV1896变异荧光PCR检测混合液A和B；酶；HBV DNA阴性血清；HBV1896野生型阳性血清；HBV1896变异型阳性血清。

1.2 检测方法

1.2.1 HBV DNA定量检测 采用荧光定量PCR法（FQ-PCR）；仪器为美国PE5700。操作依说明书。

1.2.2 HBV 1896位点变异检测 荧光PCR法；仪器为美国PE7300。操作依说明书。PCR扩增条件：37℃2 min；94℃预变性2 min；93℃变性 15 s，62℃退火延伸1 min，共40个循环。荧光检测在62℃，反应体系为 40 μl。

1.2.3 结果判定 待检样品混合液A和混合液B的荧光检测Ct值≤38，判断待检样品为HBV1896野生型；若混合液A检测Ct值≤38，混合液B检测Ct值为阴性，判断待检样品为HBV1896变异型；如果检测Ct值在38～40之间，重复检测1次，如果检测Ct值仍在38～40之间，则判为阴性。

1.3 统计学方法 计数资料采用χ2检验。

2 结果

74例乙型肝炎患者有41例发生前C区1896位点变异，占55.41%。

2.1 乙肝患者不同临床类型与前C区1896位点突变的关系 不同乙肝患者变异检出率差别有统计学意义（χ2＝14.12，P<0.01）。其中CHB组和 LC组发生变异的检出率均高于ASC组（χ2值分别为5.69和4.47，P<0.05)；但CHB组和LC组之间变异检出率差别却无统计学意义（χ2＝0.13，P>0.05）；AHB 组未检出变异株,见表1。

2.2 e系统与HBV前C区1896位点突变的关系 抗－HBe(+)组变异率明显高于 HBeAg(+)组（χ2＝11.46，P<0.01），见表 2。

表1 不同类型乙肝患者前C区1896位点变异的检出

表2 e系统与HBV前C区1896位点突变的关系

2.3 抗－HBe(+)患者不同HBV DNA含量与前C区1896位点突变的关系 不同HBV DNA含量组变异检出率差别有统计学意义（χ2＝10.44，P<0.01）。其中HBV DNA>108copies/mL 组和 107～108copies/mL 组均高于<107copies/mL组（χ2分别为 7.20和 4.59，P<0.05）；但>108copies/mL 组和 107～108copies/mL组之间变异检出率差别却无统计学意义（χ2＝2.34，P>0.05），见表 3。

表3 45例抗－HBe(+)患者不同HBV DNA含量与1896位点突变的关系

3 讨论

HBV是高度变异的，包括点突变、数目不等的碱基缺失或插入以及基因组重组，目前国内外研究得最多的一种变异就是导致HBV e抗原消失的前C区1896位点突变。HBeAg既是病毒复制和传染性的指标，又被认为是一种免疫调节因子，可抑制细胞毒性T细胞对受HBV感染的肝细胞的攻击，从而减少对HBV的免疫清除，可见前C区终止密码变异可能与机体免疫状态和疾病的发展密切相关[4]。本组74例乙肝患者中，有41例（55.41%）患者发生了1896位点突变，其中CHB和LC组突变的检出率高于ASC组。说明经过长期的炎症活动，HBV在免疫压力下，发生了变异，可使乙肝的病情加重或病情迁延，容易发生重型或慢性肝炎，甚至肝硬化。而AHB和ASC缺乏这样的经历，很少发生变异，与骆抗先等[1]报告一致。

本文对抗－HBe(+)、HBV DNA(+)但含量不同的45例患者进行了HBV 1896位点变异检测，结果71.11%发生了突变。说明随着HBV DNA含量的增加，其发生变异的检出率也增加，变异株与抗－HBe(+)肝炎患者慢性化、病情反复活动有关。由于该变异使病毒不能编码HBeAg,导致肝细胞膜上HBeAg缺失，从而诱导炎症活动，甚至可导致暴发性肝衰竭甚至肝癌的发生[5-6]。并且这些病毒变异的单独或联合发生与患肝癌风险的增加是相关的，并可预测肝癌的发生[6-7]

因此，变异与炎症活动可能是一种互为因果的关系，持续或剧烈的炎症活动将有利于变异株的优势转化[8-9]。

［1］骆抗先，杨洁，李秀惠，等.前C区A83点突变在乙型肝炎病毒感染中的分布[J].中华医学杂志，1994，74(8):478

［2］Yang HI，Shi HY，Chen PJ，et al.Associations between hepatitis B virus genotype and mutants and the risk of hepatocellular carcinoma[J].Natl Cancer,2008,100(16):1134

［3］赵素元，夏志刚.乙肝病毒变异后病毒核酸、乙肝三系、转氨酶的相关性[J].中国医学检验杂志,2007,8(5):324

［4］Chen CJ,Yang HI,Su J,et al.Risk of hepatocellular carcinoma across a biological gradient of serum hepatitis B virus DNA level[J].JAMA,2006,295(1):65

［5］王健,王平平.乙肝病毒变异与免疫逃避 [J].现代预防医学,2006,33(9):1553

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［7］Tsai WL,Lo GH,Hsu PI,et al.Role of genotype and precore/basal core promoter mutations of hepatitis B virus in patients with chronic hepatitis B with acute exacerbation [J].Scand J Gastroenterol,2008,43(2):196

［8］Liu CJ,Chen BF,Chen PJ,et al.Role of hepatitis B viral load and basal core promoter mutation in hepatocellular carcinoma in hepatitis B carriers[J].Infect Dis,2006,193(9):1258

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