胃癌组织中HIF-1α、Bax、Bcl-2的表达及意义
2010-07-13张志广卢向东闻淑军齐凤祥
吴 军,张志广,李 熳,卢向东,闻淑军,齐凤祥
(天津医科大学第二医院消化内科,天津 300211)
胃癌是我国常见的消化道肿瘤,其发生是一个多阶段、多因素参与的发展过程。近年有研究显示:肿瘤组织缺氧可以诱导产生缺氧诱导因子(HIF),而且它可能与胃癌的发病原因有关。而细胞凋亡与胃癌发生发展的关系也成为近年研究的热点。缺氧能够诱导肿瘤细胞凋亡,已在实验研究中得到证实,而缺氧时HIF-1α蛋白的表达与细胞凋亡的关系尚有争议。本研究应用免疫组化的方法检测HIF-1α、Bax、Bcl-2在胃癌组织中的表达情况,并分析其与胃癌分化程度、浸润范围、淋巴结转移的关系,探讨胃癌组织中HIF-1α表达与细胞凋亡的关系。
1 资料与方法
1.1 临床资料 收集天津医科大学第二医院及肿瘤医院1999年1月~2003年12月手术切除经病理证实为胃癌的组织标本100例作为试验组,其中男性79例,女性21例,年龄38~80岁,平均年龄61.1岁,所有病例手术前均未接受放疗、化疗或免疫治疗。其中高/中分化40例,低分化60例,有淋巴结转移52例,无淋巴结转移48例,浸润至肌层58例,浸润全层至浆膜42例。对照组为天津医科大学第二医院消化科胃镜下活检经病理证实为慢性浅表性胃炎的组织标本20例。
1.2 检测方法 两组标本均经过石蜡包埋,切片后应用免疫组化(PV9000)染色法检测100例胃癌组织,20例慢性浅表性胃炎组织 HIF-1α、Bax、Bcl-2的表达情况。鼠抗人HIF-1α单克隆抗体,鼠抗人Bax单克隆抗体,鼠抗人Bcl-2单克隆抗体,PV9000二步法免疫组化检测试剂盒均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。严格按照试剂盒说明书进行操作。以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照,用已知阳性切片作阳性对照。
光学显微镜下观察组织切片的显色反应,选择5个以上的高倍镜视野(×200),不少于1000个细胞进行计数。HIF-1α的棕黄色颗粒主要分布于细胞核及细胞浆,结果判断按照肿瘤细胞的染色比例分级,以伴或不伴细胞浆染色的细胞核染色为阳性计数标准[1],未着色(-),核染色<1%(+),核染色 1%~10%伴或不伴细胞浆染色(++),核染色11%~50%伴或不伴细胞浆染色(+++),核染色>50%伴或不伴细胞浆染色(++++),认定前3个等级为阴性表达,后2个等级为阳性表达。Bax、Bcl-2的棕黄色颗粒分布于细胞浆,结果判断根据染色程度及染色细胞百分率进行评定,基本不着色为0分,着色淡为1分,着色深为2分。着色细胞占计数细胞的百分率:0~5%为0分,6%~25%为1分,26%~50%为2分,51%~75%为3分,76%~100%为4分,将每张切片染色程度与染色细胞百分率得分相乘的积为最后得分,0~1分为(-),2~3分为弱阳性(+),4~6分为中等阳性(++),>6分为强阳性(+++),认定前1个等级为阴性表达,后3个等级为阳性表达。
1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件进行分析。两样本率的比较采用四格表资料的χ2检验,应用等级相关计数检验HIF-1α、Bax、Bcl-2三者之间的相关性。以P<0.05为检验水准,表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 胃癌组与胃炎组HIF-1α、Bax、Bcl-2蛋白的表达情况 见表1。
表1 胃癌组与胃炎组HIF-1α、Bax、Bcl-2蛋白的表达[n(%)]
2.2 胃癌 HIF-1α(+)组与 HIF-1α(-)组 Bax、Bcl-2蛋白的表达情况 见表2。
表 2 胃癌 HIF-1α(+)组与 HIF-1α(-)组Bax、Bcl-2蛋白的表达[n(%)]
2.3 胃癌组HIF-1α与Bax、Bcl-2蛋白表达的相关性分析 胃癌组HIF-1α表达与Bax表达之间存在负相关关系(r=-0.510,P<0.05);胃癌组 HIF-1α 表达与Bcl-2表达之间存在正相关关系(r=0.515,P<0.05)。
2.4 HIF-1α、Bax、Bcl-2 蛋白表达与胃癌分化程度及浸润、转移的关系 见表3。
表3 HIF-1α、Bax、Bcl-2蛋白表达与胃癌分化程度及浸润、转移的关系[n(%)]
3 讨论
在实体肿瘤的发生过程中,由于血管生长的相对滞后和肿瘤细胞的快速增殖,导致肿瘤细胞缺氧[2]。而肿瘤细胞对低氧的适应导致一系列基因的转录,这些基因参与血管生成,铁和糖的代谢及细胞增殖的过程。介导这一过程的首要因子即缺氧诱导因子(HIF),它包括构成性表达的亚单位HIF-1β和氧调节亚单位HIF-1α,后者的稳定性和活性受多种因素的调节[3]。HIF-1在实体肿瘤的生长和生存中起着重要的作用,HIF-1α的过表达现象已在人类许多肿瘤中发现[4]。Zhong等[5]对包括胃癌、胰腺癌在内的多种癌组织标本及人体正常组织分析发现,大多数人体正常组织中没有或仅有弱阳性的HIF-1α表达,而癌组织中HIF-1α呈过表达。本研究发现,HIF-1α阳性表达率胃癌组织(56%)高于慢性浅表性胃炎组织(5%),二者之间的差异有统计学意义(P<0.05),提示HIF-1α过表达在胃癌的发生发展过程中可能起重要的作用。
近年来,人们认识到细胞凋亡同细胞增殖分化一样,是维持细胞和组织平衡的重要机制。细胞凋亡异常是肿瘤形成的重要病理基础,参与肿瘤发生发展的过程。凋亡相关蛋白Bcl-2家族在细胞凋亡的调控中起着极为重要的作用[6],其中成员Bcl-2作为一种重要的凋亡抑制基因,而Bax是Bcl-2家族中第一个被确认为有细胞凋亡促进作用的成员,它不但可以拮抗Bcl-2的凋亡抑制作用,而且还可以直接促进细胞凋亡,在细胞凋亡过程中起着重要的枢纽作用。有研究显示,在胃腺癌中Bcl-2蛋白高表达,而Bax蛋白低表达,这一现象提示抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax分别在胃癌发生中起到抑制凋亡与促进凋亡的作用[7]。本研究结果发现,胃癌组织中存在Bax蛋白的低表达,Bcl-2蛋白的高表达,提示胃癌组织中促凋亡因素减弱,而抗凋亡因素增强,细胞的增殖与凋亡平衡失调,可能参与胃癌发生发展的过程。
HIF-1α表达增加究竟是促进细胞凋亡还是抑制细胞凋亡尚有争议。有的研究显示,在人胃癌细胞系MKN-1中,HIF-1α表达与细胞增殖和凋亡相关,外源性上调胃癌组织中HIF-1α表达可通过增加抗凋亡蛋白表达,减少促凋亡蛋白表达,抑制细胞凋亡的发生[8]。而有的研究却显示,缺氧可以引起肿瘤细胞凋亡,即肿瘤细胞在适应了低氧环境的压力,耐受缺氧后而诱导细胞凋亡的发生,这一过程的核心调节者为HIF-1α,它可以诱导高浓度的促凋亡蛋白而引发细胞凋亡[9]。鉴于上述研究结论的不一致,我们选择了促凋亡蛋白Bax,抗凋亡蛋白Bcl-2来反映肿瘤细胞发生凋亡的情况,应用免疫组化染色法检测HIF-1α、Bax、Bcl-2三者在胃癌组织中的表达情况并分析其相关性,结果显示:HIF-1α蛋白的表达与Bax蛋白的表达之间存在负相关关系,而与Bcl-2蛋白的表达之间存在正相关关系,提示肿瘤缺氧产生的HIF-1α过表达可能通过降低促凋亡蛋白Bax的表达,增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,抑制肿瘤细胞发生细胞凋亡。HIF-1α高表达减少Bax蛋白的表达,增加Bcl-2蛋白的表达提示HIF-1α的高表达有抑制细胞凋亡的效应,这与有的报道HIF-1α的高表达有促进细胞凋亡的效应结论不一致,原因考虑可能与选择的凋亡相关蛋白不同有关,也可能HIF-1α高表达在不同的条件下有抑制细胞凋亡和促进细胞凋亡的双重效应,有待进一步深入研究揭示HIF-1α的表达与细胞凋亡的关系。我们通过研究认为,HIF-1α表达增加可以抑制胃癌细胞发生凋亡,或许是HIF-1α参与胃癌发生发展过程的机制之一。
本研究结果显示,HIF-1α蛋白在有淋巴结转移组中的表达显著高于无淋巴结转移组的表达,在肌层浸润组的阳性率显著高于全层至浆膜浸润组,这与崔宝红等[10]的研究结论一致,提示HIF-1α蛋白与胃癌浸润范围及淋巴结转移有关。Bax蛋白在高/中分化组中的表达显著高于低分化组的表达,这与潘科等[11]的研究结论一致,在全层至浆膜浸润组的阳性率显著高于肌层浸润组;而Bcl-2蛋白在高/中分化组中的表达显著低于低分化组的表达,这与梁俊国等[12]的研究结论一致,在全层至浆膜浸润组的阳性率显著低于肌层浸润组,提示Bax、Bcl-2蛋白与胃癌分化程度及浸润范围有关。可见,HIF-1α、Bax、Bcl-2蛋白表达与胃癌分化、浸润、转移密切相关。
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