异氟烷对老年大鼠学习、记忆能力及海马nNOS表达的影响

赵洪伟，陆冠宇，徐志鹏，冯春生，王 云，吴安石，岳 云

（1.天津医科大学肿瘤医院麻醉科，天津 300060；2.首都医科大学附属北京朝阳医院；3.吉林大学第一医院）

患者麻醉和手术后出现的学习记忆功能损害，即术后认知功能障碍 (postoperative cognitive dysfunction,POCD)近年来受到重视[1-2]。特别是老年患者POCD发病率更高，老龄已被认为是POCD明确的危险因素，但其机制尚不明确[1]。研究表明，大脑海马组织的神经元型一氧化氮合酶(neuron-nitric oxide synthase,nNOS)被抑制，一氧化氮 (nitric oxide,NO)生成减少，可能是动物学习、记忆过程受损的中枢机制之一，而全麻药物丙泊酚可能抑制了nNOS的表达[3]。目前，关于吸入全麻药对nNOS表达及NO生成影响的研究较少。因此，本研究拟测试不同时间异氟烷麻醉后，老年大鼠Morris水迷宫训练成绩和海马CA1区nNOS表达的变化，以探讨异氟烷对老年大鼠中枢认知功能影响的机制，为临床上老年患者POCD的发生提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物选择及分组 健康雄性Sprague-Dawley老年大鼠（20月龄）36只（四川省医学科学院实验动物研究所）。根据大鼠的麻醉时间和Morris水迷宫测试开始时间，将其随机分为6组，每组6只：（1）空白对照组：不麻醉，不行水迷宫测试，只取海马CA1区脑组织检测nNOS表达情况；（2）训练对照组：不麻醉，但进行水迷宫测试，测试后取海马CA1区脑组织检测nNOS表达情况；（3）异氟烷2 h/2 d组：异氟烷（1.2%）麻醉持续2 h，2 d后行水迷宫测试，测试后取海马脑组织检测nNOS表达情况；（4）异氟烷2 h/2周组：同（3）组，但水迷宫测试在麻醉后2周进行；（5）异氟烷4 h/2 d组：异氟烷（1.2%）麻醉持续4 h，2 d后行水迷宫测试，测试后取海马脑组织检测nNOS表达情况；（6）异氟烷 4 h/2周组：同（5）组，但水迷宫测试在麻醉后2周进行。

1.2 方法

1.2.1 麻醉方法 异氟烷（批号：NO58M106，Baxter公司，美国）麻醉：吸入浓度1.2%，实验时将动物置于正方体麻醉箱内，麻醉箱有两个侧孔，一侧孔连接Ohmeda210麻醉机（Datex-Ohmeda公司，芬兰），用挥发罐控制麻醉气体输出浓度；另一个侧孔接FMCI气体监测仪（Datex-Ohmeda公司，芬兰）监测流出气体中异氟烷浓度。麻醉过程中用婴儿脉搏血氧饱和度探头贴于大鼠腹部，监测SpO2和心率；经尾部动脉置管，间断采集尾部血，以i-STAT型血气分析仪（Abbott公司，美国）行血气分析。

1.2.2 Morris水迷宫测试 采用Morris水迷宫定位航行实验（place navigation test）测试大鼠的学习、记忆能力，测试共历时5 d。实验前1 d将大鼠放入水池（不含平台）自由游泳，让其熟悉环境。实验之日起，每天分上、下午两个时间段，每个时间段训练4次，每天共8次。训练时将平台置于西南象限（没于水下1 cm左右），4次训练将大鼠分别从4个不同起始点面向池壁放入水池中，图像自动监视系统追踪大鼠的游泳轨迹，并记录大鼠找到平台的时间，即逃避潜伏期(escape latency)。找到平台后允许动物在平台上休息30 s，再进行下次实验。每天8次成绩的平均值为当日成绩。认知测试过程中保持实验室内灯光、物品等空间参照物摆放位置不变，以排除环境干扰。

1.2.3 海马CA1区nNOS表达的测定 大鼠认知功能测试完毕后立即开胸、插管，先以0.1 mol·L-1PBS磷酸缓冲液300～400 ml冲洗血液，再用含4%多聚甲醛的0.1 mol·L-1PBS磷酸缓冲液（pH7.4)300～400 ml灌注固定，然后断头取出全脑，置于30%蔗糖（含4%多聚甲醛）液中进行后固定（4℃，过夜），直至组织沉底。Cryotome E冰冻切片机连续冠状切片，取每只大鼠脑前囟后3～3.5 mm范围为实验部位，片厚 35 μm，每隔 5片取1片。用0.01 mol·L-1PBS漂洗3次，放入含0.3%Triton的PBS液中30 min。然后免疫组化染色，切片加入兔抗nNOS IgG稀释液（1∶1000），37℃孵育4 h后4℃过夜；之后加入生物素标记的抗兔 IgG 抗血清（1∶500），37℃孵育 4 h；再加入生物素-亲合素-辣根过氧化物酶复合物，室温孵育1 h后，滴加DAB显色液作呈色反应，最后裱片，晾干，脱水，二甲苯透明后封片。

光镜下每一切片选取相同区域的4个视野，计算每个视野免疫反应阳性细胞数，计算其平均值。所有切片均在同一放大倍数（×400）及同一光强度下分析。

1.3 统计学处理 以SPSS12.0软件包处理数据，所有数据以均值±标准差（±s）表示，统计学分析采用单因素方差分析（ANOVA）和t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 大鼠吸入1.2%异氟烷后数分钟内翻正反射均消失，呈持续睡眠状态。各组大鼠鼻唇、趾端肤色保持红润，呼吸频率>90次/min。SpO2和心率无明显波动，血气分析指标均在正常范围。

2.2 Morris水迷宫行为学测试结果 各组老年大鼠随着训练天数的增加，逃避潜伏期相应缩短。但与训练对照组同期相比，老年大鼠4 h/2 d和4 h/2周组的逃避潜伏期在第2～5天明显延长（P<0.05）；而2 h/2 d和2 h/2周组的变化没有显著性（图1）。将各组第5天测试的逃避潜伏期平均值作为训练总成绩（表1），总的来看，老年大鼠异氟烷麻醉后水迷宫训练总成绩低于训练对照组（P<0.05），即逃避潜伏期延长，其中4h/2d组和4 h/2周组逃避潜伏期最长，而2 h/2周组没有显著变化。

图1 各组Morris水迷宫同期测试成绩*与训练对照组相比，第2～5天的逃避潜伏期延长（P<0.05）

表1 各组Morris水迷宫训练总成绩的变化（n=6,±s）

表1 各组Morris水迷宫训练总成绩的变化（n=6,±s）

与训练对照组相比，*P<0.05

训练对照组11.78±13.58异氟烷2 h/2 d组15.83±17.35*项目逃避潜伏期（s）空白对照组—异氟烷2 h/2周组8.87±6.49异氟烷4 h/2 d组18.58±20.90*异氟烷4 h/2周组24.11±36.84*

2.3 大鼠海马CA1区nNOS的表达 空白对照组大鼠海马CA1区，免疫组化染色基本呈阴性。经水迷宫训练后，大鼠海马CA1区nNOS免疫组化染色呈阳性，阳性物质在镜下呈浅黄色到深棕黄色，细颗粒状，为胞浆染色。

与空白对照组相比，训练对照组大鼠海马nNOS阳性细胞数明显增多（P<0.05）；而异氟烷麻醉后各组nNOS阳性细胞数均不同程度下降，其中4 h/2 d和4 h/2周组的nNOS阳性细胞数与训练对照组相比均显著性下降（P<0.05），见图2。

图2 大鼠海马脑组织nNOS表达情况老年大鼠4 h异氟烷麻醉后，nNOS表达与空白对照组比较，#P<0.05；与训练对照组比较，*P<0.05

3 讨论

POCD发生在术后，因此全麻药物引起POCD发生的研究近年来受到关注。动物全麻后出现的认知功能障碍，难以由相关药物的药代动力学特性解释，并且尽管麻醉药能被迅速消除，全麻后某时期大脑仍可能有形态学和功能上的改变，因此推测这种损害可能代表了全麻药对学习、记忆功能相关的神经细胞分子生化水平的影响[4]。研究表明，全麻药物可能作用于中枢神经系统的某些递质和受体，导致部分神经细胞凋亡，或改变神经细胞蛋白质表达等，从而开始了对全麻药物与POCD关系的初步探索[5-6]。

异氟烷是临床上常用的吸入全麻药，具有苏醒快、循环功能影响小的特点，不过多项研究表明异氟烷麻醉可导致POCD发生[7]。本研究选择1.2%异氟烷进行麻醉，结果表明大鼠吸入此浓度异氟烷后麻醉效果满意[8]。

Morris水迷宫是神经生物学领域研究动物空间学习、记忆功能常用的方法，能够较准确的反映受试动物以视觉为基础的空间定向及定位能力的变化[9]。本实验利用Morris水迷宫对异氟烷麻醉前、后老年大鼠的空间学习、记忆能力进行测试。结果与训练对照组相比，长时间（4 h）异氟烷麻醉后老年大鼠近期（2 d）和远期（2周）的逃避潜伏期均延长，而短时间麻醉（2 h）后只有近期（2 d）逃避潜伏期延长，而远期（2周）则无变化。逃避潜伏期延长，即老年大鼠学习记忆速度下降，这一结果提示异氟烷麻醉引起老年动物认知能力的下降随麻醉时间延长而加重，并且麻醉时间越长，认知能力受损持续的时间也越长；而短时间麻醉引起的认知能力障碍相对较轻，并且持续时间较短，到麻醉后2周时，认知功能已基本恢复。

目前，已经公认大脑海马部位的突触后长时程增强（long-term potentiation,LTP）是反应神经细胞突触可塑性的功能指标，是学习记忆形成的神经基础[10-11]。LTP是突触前、后机制共同作用的结果，其中由nNOS催化生成的NO是首先被确认的一种参与LTP形成的逆行信使，因此中枢内的nNOS可能是参与学习记忆机制的关键酶[12-13]。与以往研究结果相似[10,14]，本研究中训练对照组大鼠海马nNOS阳性细胞数显著增加，表明大鼠在水迷宫学习记忆强化训练过程中，神经元细胞nNOS表达增加，使NO生成增加，满足海马对NO的需要。

研究指出，POCD可能与全麻药物丙泊酚抑制nNOS表达及NO生成有关[3,15]。本研究中，预先实施异氟烷麻醉后再行水迷宫训练的老年大鼠海马脑组织nNOS近期（2 d）及远期（2周）表达情况均呈不同幅度的下降，特别是长时间麻醉（4 h）后nNOS表达下降更为显著，此与Morris水迷宫行为学测试结果是一致的。该结果表明长时间异氟烷麻醉后老年大鼠出现认知功能障碍，可能与异氟烷抑制海马nNOS表达，导致NO生成下降，从而影响LTP的形成有关。

综上所述，吸入全麻药异氟烷抑制海马脑组织nNOS的表达可能是其长时间麻醉后老年大鼠空间学习、记忆能力受损的中枢机制之一。

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