北京地区枣疯病植原体16S rDNA基因序列分析

林文力，牟海青，廖晓兰

（1.湖南农业大学生物安全科学技术学院，湖南 长沙 410128；2.中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所，北京 100029）

植原体（Phytoplasma），原称类菌原体（Mycoplasma-like orpanism，简称MLO）是一类无细胞壁、存在于植物筛管内的专性寄生细菌，主要依靠叶蝉和飞虱等从韧皮部取食的昆虫传播，也可由菟丝子和人工嫁接传病，常引起植物从枝、黄化、花变叶、顶枯等症状[1]。综合世界各地的报道，植原体可引起多达1 000余种植物的系统性病害，涵盖各类农作物、园艺、花卉、果树和林木等病害。其中，我国报道的有100多种，给经济作物造成了巨大损失[2]。由于植原体尚不能进行体外培养，故对其生物学特性研究较少。近年来，随着分子生物学的迅速发展，核酸杂交、血清学和PCR等技术的广泛应用，极大改善了研究者对植原体鉴定和分类的手段[3]。根据植原体通用引物和特异性引物可以特异地扩增出16S rDNA基因序列，这是植原体分类的重要参考依据,也是被国际上普遍接受的植原体鉴定分类方法[4]。

枣树在我国广泛栽培，遍布全国各地，是一种重要的经济作物。枣疯病（Jujube witches′-broom，JWB）是由植原体引起的一类病害，枣树一旦患病,通常在2～3 a内丧失产量并很快导致植株死亡。1981年，王祈楷等通过系统比较，确定了枣疯病是由植原体侵染所引起的，而不是病毒类或者病毒与植原体的复合侵染所致。枣疯病发病过程从外观上看可分为以下几个阶段：健康叶片→花叶→变态花蕾→花变叶→丛枝[5]。

本研究对我国北京地区枣疯病植原体16S rDNA基因进行PCR扩增及序列测定，并与已知的植原体序列构建系统发育进化树，明确北京地区枣疯病的分类地位，以期为枣疯病植原体的遗传变异、致病机理等研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

发病枣树样品采自北京昌平区西峰山村小枣林。克隆载体PMD18-T、限制性内切酶及其它酶类等分子生物学试剂均购自TaKaRa公司；PCR产物回收试剂盒、质粒回收试剂盒购自北京全式金生物科技有限公司。

1.2 植物总DNA提取

照顾沛雯等[6]的方法提取植物样品的总DNA，于-20℃环境下保存备用。

1.3 PCR扩增、克隆及序列测定

利用Gundersen等[7]设计的通用引物,通过巢式PCR扩增植原体16S rDNA。PCR以植株总DNA为模板,以 R16F2n（5′-GAAACGACTGCTAAGACTG G-3′）和 R16R2（5′-TGACGGGCGGTGTGTACAAA CCCCG-3′）引物对进行扩增。扩增条件为:94℃预处理 5 min；94℃ 40s，55℃ 1 min，72℃ 2 min，共 35 个循环；最后72℃10 min。1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。PCR扩增出的目标产物纯化回收，克隆入PMD18-T载体中，通过PCR筛选阳性克隆，序列测定委托北京诺赛基因组研究中心有限公司完成。

1.4 序列分析及同源性比较

利用GenBank数据库中的BLAST程序对测序结果进行同源性检索（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），通过 DNAMAN5.2.2及 MEGA4.1软件进行同源性比较及系统关系树的构建。

2 结果与分析

2.1 PCR检测结果

枣疯病感病植株总DNA经直接PCR及巢式PCR扩增后,得到大小约1.2 kb的特异片段，片段大小与引物设计的相符，而健康植株和双蒸水对照均未出现特异扩增带（图1）。将此植原体命名为枣疯病西峰山枣株系（JWB-XFSZ）。

2.2 植原体16S rDNA片段的序列分析

将16S rDNA目的片段克隆后测序，结果表明北京昌平区西峰山村小枣（JWB-XFSZ）的16S rDNA扩增片段含有1248个核苷酸（表1），G+C的含量为45.7%。利用GenBank中的BLAST程序对测序结果进行同源性检索，北京昌平地区枣疯病与16SrⅤ组各植原体的16S rDNA基因序列同源性达98.5%以上，其中与16S rⅤ组的榆树黄化有98.96%、与悬钩子丛枝病有98.64%的同源性。JWB-XFSZ与16SrV-C亚组的枣疯病韩国株系（登录号AB052879）同源性最高，达99.51%，而与其它16Sr其它各组的同源性均在95%以下，表明JWB-XFSZ和枣疯病韩国株系一样应归属于16SrV-C亚组。

表1 JWB-XFSZ 16S rDNA基因的测序结果

2.3 枣疯病植原体系统树构建与分析

将已登陆Genebank的部分植原体16S rDNA基因序列下载下来，与JWB-XFSZ所测定的16S rDNA序列进一步进行同源性分析，利用MEGA4.1软件构建系统发育树（图2）。由系统发育树可以看出，JWB-XFSZ与JWB不同地区的株系；与Elm yellows、Honeylocust yellows、Cherry lethal yellows、Hemp fiber witches-broom、Peach yellows以及 Paper mulberry witches-broom等16SrⅤ组的植原体在同一个进化枝上，说明JWB-XFSZ与16SrⅤ组的亲缘关系最近。

图2 构建28种植原体株系16S rDNA基因核苷酸序列同源关系进化树

3 讨 论

16S rDNA是原核生物染色体基因组中的一种rDNA编码区序列，在进化中高度保守，常作为原核生物系统发育及分类研究的标准方法。本研究运用分子生物学的方法对北京西峰山小枣枣疯病植原体的16S rDNA进行PCR扩增，并对扩增产物进行克隆、序列测定及同源关系分析,确定了该植原体株系的分类地位。

目前，国内外学者对枣疯病植原体病原做了大量研究，以期为枣疯病的防治提供参考依据。Seemüller等[8]认为植原体病害虽发生在世界各地，但不同组及亚组的植原体在分布上存在明显的地区差异，如16S rV-A主要发生在北美国家，16S rV-C主要发生在欧洲，而16S rV-B主要发生在亚洲。从本研究扩增到的枣疯病植原体16S rDNA基因来看，JWB-XFSZ 株系与 JWB-henan、JWB-Zahuangdazao、JWB-xiangshan、JWB-Junzao 以 及JWB-Kor各株系均只有几个碱基的差异，说明枣疯病植原体暂时还未存在株系上的变化。JWB-XFSZ株系与JWB-Kor韩国株系的差异最近，说明北京西峰山枣疯病植原体与韩国报道的植原体是同一种病害。在本研究过程中在病株样品中未扩增到其他植原体，说明未存在复合侵染的现象。

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[8]Seemüller E,Marcone C,Lauer U,et al.Current status of molecular classification of the phytoplasmas [J].Journal of Plant Pathology,1998,80（1）：3-26.