血清冷球蛋白定量检测在丙肝肝硬化诊断中的应用研究△

天津市河西医院(天津 300202)徐 心 王 沂 顾春刚 史 勇 刘淑学

现已明确丙型肝炎病毒(HCV)感染除引起肝脏病变外,还可引起多种肝脏外组织损害[1]。混合型冷球蛋白血症(Mixed cryoglobulinemia,MC)是最为常见的 HCV感染肝外表现之一[2]。目前,伴发冷球蛋白血症的 HCV感染导致肝纤维化的分子学机制正成为国外研究的热点[3]。目前国内尚未见有关CG在丙肝肝硬化诊断中的研究报道,本研究旨在探讨血清 CG在HCV感染合并肝纤维化的诊断价值,现报告如下。

资料与方法

1 一般资料 病例来源于天津市河西医院及天津市第三中心医院住院及门诊丙型肝炎与丙肝肝硬化患者 68例,其中男性 36例,女性32例,年龄15～ 78岁,其中丙肝肝硬化患者23例。所选病例均符合2000年全国《病毒性肝炎防治方案》诊断标准[4]及“肝纤维化诊断及疗效评估共识”[5]的肝硬化诊断标准。对照组 50例,为我院健康查体者,男女各 25例,均在清晨空腹采血。

2 检测仪器及试剂

2.1 仪器:V ITALAB-MICRO半自动生化分析仪(荷兰VIT AL公司);SIGMA 2-MK低温离心机(美国 SIGM A公司);PH-3B型数字式酸度计(江苏电分析仪器厂 B-42);分析天平(万分之一,上海长江科学仪器厂 TG-328A);二六二厂XH-6020G免疫计数器;美国 PE公司 GA-5700荧光检测仪。

2.2 试剂:冷球蛋白(CG)定量检测试剂自配[6];透明质酸 (HA)、层粘蛋白 (LN)、Ⅲ 型前胶原 (PCⅢ )、Ⅳ型前胶原(PCⅣ)采用上海海研医学生物技术中心放射免疫试剂盒;HCV-RNA扩增引物选自 HCV基因组保守区 5′端 NC区 nt序列。引物(primer,p)序列如下:pl 5′-AACTACTGTCTTCACG-CAGA-3′,p2 5′-CGCAGCACCCTACAGGCAG-3′,由上海 生物 工程技术服务有限公司合成。

3 方 法

3.1 CG定量法:在半自动生化分析仪上的参数为波长598nm,温度37℃,比色杯1.0cm。血标本在室温高于20℃时采取。预温注射器及试管,分离血清1mL于Eppendorf管中,置 4℃冰箱中,7d后,在低温离心机中2957×g离心 20min,将沉淀物用 0℃蒸馏水洗涤 2次后,在沉淀物中加入2mL邻苯三酚红试剂,37℃ 5min,以试剂空白调零点,598nm处比色。计算方法:CGmg/L=U/S× 70mg/L。

3.2 透明质酸(HA)、Ⅲ 型前胶原 (PCⅢ )、Ⅳ型前胶原(PCⅣ )层粘蛋白(LN)依据说明书在XH-6020放免仪上检测。

3.3 HCV-RNA检测:应用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)法检测。

3.4 统计学分析:应用 SPSS 11.5软件,采用t检验,相关分析采用 Pearson相关。

结 果

1 用 RT-PCR法检测 68例 HCV阳性患者,其中23例丙肝肝硬化。对照组50例,分别检测其血清CG含量。结果见表1。CG＞293.2mg/L组与其他两组比较,在单纯 HCV感染患者中有显著性意义(P＜0.01);在丙肝肝硬化患者中有显著性意义(P＜0.01)。提示 CG升高与 HCV感染及丙肝肝硬化的发生有着密切的联系。

2 检测不同年龄 CG在 HCV感染及丙肝肝硬化中的含量,见表 2。

通过对 HCV感染及丙肝肝硬化患者不同年龄 CG含量检测的结果分析发现,在单纯 HCV感染的不同年龄组之间,CG定量检测结果无统计学意义 (P＞0.05);在丙肝肝硬化患者的不同年龄组之间,CG定量检测结果有显著性意义(P＜0.01)。表明CG含量与肝纤维化的年龄呈正相关。

3 检测患者携带 HCV病毒不同持续时间的 CG在 HCV感染及丙肝肝硬化中的含量,见表3。

通过对患者携带 HCV病毒不同持续时间CG含量检测的结果分析发现,在单纯 HCV感染组及丙肝肝硬化组中,携带HCV病毒不同的持续时间组之间,CG定量检测结果有显著性意义(P＜0.01)。表明CG含量在两组患者中均与携带 HCV病毒持续时间呈正相关。

4 检测不同性别 CG含量与肝硬化发生的关系,见表 4。

表1 血清 CG定量在患者组与对照组的结果(%)

表2 血清 CG在不同年龄患者组的检测结果

表3 血清 CG在不同病程患者组的检测结果

表4 不同性别患者组血清 CG的检测结果与肝硬化关系

在 CG＞ 293.2mg/L组中,男女发生肝硬化的比率无显著性意义(p＞ 0.05);在 88.7mg/L＜CG＜293.2mg/L及 CG＜88.7mg/L组中,因观察病例较少,不能说明问题。在这项研究中,CG＞293.2mg/L组在性别方面无显著性差异与 Schmidt等[7]人存在分歧,与Kayali Zeid等[3]的结果相一致。由于男性通常被认为是进行性肝脏疾病的一个危险因素,因而CG与肝纤维化发展的临床和分子学关系需进一步研究。

5 血清 CG定量与其他肝纤维化指标相关性分析 ,见表 5。

表5 CG与肝硬化指标相关性分析

讨 论

冷球蛋白(Cryoglobulin,CG)是血清中存在的30℃易于聚合、4℃沉淀、37℃溶解的病理性免疫球蛋白。根据免疫球蛋白(Ig)的组成和冷球蛋白血症患者的冷球蛋白的特性将冷球蛋白分为 3型[9]:I型由单一的单克隆 Ig组成;II型由单克隆的 IgM和多克隆的IgG组成;III型由多克隆的IgM和多克隆的IgG组成,单克隆和多克隆 IgM具有类风湿因子(RF)活性,II型和 III型冷球蛋白血症又称为混合型冷球蛋白血症(Mixed cryoglobulinemia,MC)。

20世纪 80年代末发现 HCV以来,丙肝与冷球蛋白血症的关系迅速得到公认;丙肝病毒的包膜蛋白 E2可以与一种细胞膜蛋白 CD81结合,在B细胞上,CD81与 CD19、CR2、M HC II类分子存在联系,当 HCV与CD81结合后,可激活上述分子形成的复合物,降低抗体产生所需的抗原阈,使 B细胞反应性增高,导致在骨髓和肝脏中形成产生 II型冷球蛋白的优势 B细胞克隆,这可能是 HCV感染易合并MC的机制[7,10]。

肝纤维化是肝组织内细胞外基质(ECM)成分过度增生与异常沉积,导致肝脏结构或功能异常的病理过程,结构上表现为肝窦毛细血管与肝小叶内以及汇管区纤维化;功能上可以表现为肝功能减退、门静脉高压等。丙肝病毒感染后,很多病人发展成为持续性病毒血症和肝纤维化,肝纤维化可进一步发展成为肝硬化。

伴发冷球蛋白血症的 HCV感染导致肝纤维化的分子机制正成为研究的热点。目前已经获得的数据显示细胞介导的宿主免疫反应有可能是导致肝脏纤维化的原因。宿主免疫反应导致炎症细胞和肝细胞释放旁分泌因子,诱导肝窦内肝星状细胞的活化,胶原等ECM成分代谢失衡,生成大于降解,促使肝脏 ECM沉积与结构重构[11]。肝纤维化的诊断迄今仍以肝组织病理学检查最为可靠,由于肝穿活检为创伤性检查,所取标本有其局限性,难以常规用于随访和动态观察。近20年来,对肝纤维化的血清学综合诊断取得显著进展[12]。透明质酸(HA)、Ⅲ型前胶原肽或其代谢片段(包括 PⅢ P或 PCⅢ )、Ⅳ型胶原或其代谢片段(包括ⅣC、Ⅳ 7S、Ⅳ NC1)及层粘蛋白 (LN)构成正常肝脏结缔组织“功能性”基底膜。当肝脏发生纤维化时,ECM较正常肝增加 2～ 20倍 ,HA、 PⅢ P或 PCⅢ、Ⅳ C、Ⅳ 7S、ⅣNC1及 LN可作为肝纤维化的标志物,用于肝纤维化的诊断,这些标志物均须放免法检测。

我们对68例临床确诊HCV感染及23丙肝肝纤维化患者血清 CG、HA、PCⅢ、PCⅣ、LN指标进行检测,其结果表明CG定量检测在单纯 HCV感染及丙肝肝硬化中均显著高于对照组,且随年龄、病程、纤维化程度的发展而增高;与肝纤维化标志物 HA、PCⅢ、PCⅣ、LN具有良好的相关性。并且,CG检测在肝纤维化分级中,具有重要意义,提示 CG与肝纤维化活动密切相关。因此,CG定量检测可以作为判断慢性HCV感染有无肝纤维化的指标,并能监测慢性丙型肝炎肝纤维化的动态变化。

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[5]中华医学会肝病学分会肝纤维化学组.肝纤维化诊断及疗效评估共识.中华肝脏病杂志,2002,10:327-328.

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