WWOX在结直肠癌中的表达及其与 Bax的相关性*

贵阳医学院病理学教研室 (贵阳550004)何 常 陈志英 李 珀 王菊芳 钟 愉

WWOX基因是 2000年新发现的在普通型脆性位点 FRA16D上的侯选抑癌基因,跨越了基因组内 STS markers D16s518和 D16s516的一个大于 100万 bp的区域[1]。国外学者近年研究发现WWOX与Bax蛋白相互作用,共同参与了一些恶性肿瘤的发生发展,并与其生物学行为及预后有密切关系。本实验用免疫组化EnVision二步法检测两者在结直肠癌及结直肠炎症中的表达,探讨其与结直肠癌发生发展及相互之间的可能关系。

材料及方法

1 标本来源 收集贵阳医学院附属医院 1994～1998年间结直肠癌手术切除标本共 368例,所有患者术前均未经化学治疗和放射治疗。为了排除组织学类型及治疗方法不同对预后的影响,我们选取了其中同一组织学类型(管状腺癌 II级)及相同治疗方法(根治+化学治疗)并有完整临床随访资料的病例 58例,生存期的计算是从手术日期起到随访日期或由于复发、转移而死亡的日期,随访主要采用电话、门诊及信访方式获得,随访率81%,失访者和非癌死亡者未纳入本组病例,本组 5年生存率 51.7%。本组中男性 28例,女性30例,年龄28～ 75岁;发生于升结肠11例、横结肠10例、降结肠16例、直肠21例。同时收集同期肠镜活检结直肠炎症标本20例。所有标本均经10%中性福尔马林固定,常规石蜡包埋,切片厚 4 μ m。

2 试剂及方法 WWOX兔抗人多克隆抗体购至英国Abcom公司,工作浓度为1∶300,鼠抗人Bax单克隆抗体购至北京中杉金桥生物技术有限公司,工作浓度为 1∶300,PV-9000试剂盒购至北京中杉金桥生物技术有限公司。本试验采用EnVision二步法行免疫组化染色,操作严格按照说明书进行,每次染色均设阳性对照及阴性对照。

3 结果判定 WWOX及 Bax阳性均为细胞浆着色呈黄色,结果判定用阳性细胞数量和着色程度两相加权法,即每张切片观察 10个高倍视野,每个高倍视野记数 100个细胞,其中阳性细胞数 5%、＞5%～25%、26%～ 50%、＞ 50%时分别记 0、 1、2、3分;着色强度 (颜色)按未着色、淡黄色、棕黄色、黄褐色分别记0、1、2、 3分 ,两项评分相加 ,总分 0～ 1分记为 (-),2分 记为 (+ ),3～ 4分记为 (++ ),5～ 6分记为 (+++)。

4 统计学处理 应用 SPSS13.0软件进行分析,癌组织与对照组间蛋白表达的比较及癌组织中WWOX蛋白表达与临床病理相关因素的关系用χ2检验,蛋白间相关性用χ2关联性分析,P＜0.05为差异有显著性。

结 果

1 WWOX、Bax在不同结直肠组织中的表达结直肠癌组织中 WWOX、Bax的表达阳性率分别为25.86%(15例),58.62%(34例);炎症对照组中两者的表达阳性率分别为65%(13例),85%(17例).结果表明结直肠癌中 WWOX和 Bax蛋白的表达明显低于对照组,两者间差异有显著性(P＜0.01),见表1。

表1 结直肠癌及结直肠炎症中WWOX、Bax的表达

2 WOX、Bax的表达与结直肠癌临床病理参数之间的关系 WWOX、Bax在结直肠癌中的表达与患者的性别、年龄、淋巴结转移、Dukes分期无关(P＜0.05),与预后相关,差异有显著性(P＜0.01,P＜0.05),且WWOX的表达在癌组织的浸润深度间差异有显著性(P＜0.05)。Bax的表达在癌组织的浸润深度间差异无显著性(P＞0.05),见表 2。

表2 WWOX、Bax的表达与结直肠癌临床病理参数之间的关系

3 结直肠癌组织中WWOX与Bax表达的相关性经χ2关联性分析表明WWOX与 Bax的表达呈正相关(P ＜0.05)。

讨 论

WWOX基因是 Bednarek等[1]在 2000年用霰弹法克隆鉴定得到的一个新的包含有 FRA16D(16q23.3-q24.1)的基因,并跨越了基因组内 STS markers D16s518和 D16s516的一个大于 100万 bp的区域,这个区域位于染色体的 16q23.3-q24.1(普通型脆性位点,FRA16D)。近年来大量的研究表明FHIT蛋白在大部分肿瘤中明显降低,WWOX基因与对应于常见染色体脆性位点 FRA3B的 FHIT基因非常相象,并且它的表达异常也与多种肿瘤密切相关,故被认为是继 FHIT基因之后的又一个新的抑癌基因。

目前人们通过研究已经在多种肿瘤中发现了WWOX的表达异常,而且主要是上皮组织的癌。 S-W Park等[2]报道与正常肝组织相比,在 18例肝细胞癌细胞株中就有 13株的 WWOX蛋白表达减少甚至未表达,提示WWOX基因与肝癌的发生可能有密切关系。Raim I.Aqeilan等[3]应用免疫组化检测了原发性胃癌中WWOX蛋白的表达,结果发现阳性率仅为35%,明显低于正常胃组织。另外在肺小细胞肺癌、前列腺癌、膀胱癌等[4,5]组织中也发现了 WWOX蛋白的表达异常。本次试验中我们应用免疫组化方法检测了结直肠癌组织及结直肠炎症对照组中WWOX蛋白的表达,结果显示WWOX在癌组织中的表达明显低于对照组,这与其他相关报道相符,提示WWOX蛋白的低表达可能在结直肠癌的发生中起了重要作用。另外在实验中我们发现WWOX在结直肠癌中的表达与癌组织的浸润深度及患者的预后密切相关(P＜0.05,P＜0.01)。目前WWOX蛋白在人肿瘤中的详细作用机制还不清楚,但有研究表明在鼠的体内,WWOX的类似物WOX1已被证实是 TNF-α介导的细胞凋亡过程中必不可少的中介物。WOX1位于细胞的线粒体内,TNF通过诱导线粒体膜通透性的改变而导致WOX1从线粒体释放,促进细胞的凋亡。根据人和鼠间的高度同源性我们分析当WWOX蛋白低表达甚至失活时,影响了TNF的作用过程,从而降低或丧失对细胞凋亡的控制,导致肿瘤的发生。

Bcl-2家族在细胞凋亡的调控中扮演了重要的角色,是目前细胞凋亡研究的热点之一。 Bax是 Bcl-2家族中最重要的促进凋亡蛋白,定位于细胞浆,自身可形成同源二聚体或与Bcl-2形成异源二聚体。它广泛分布于人体组织和细胞,尤其在肝脏、肾小管、胰岛等表达较高。在多种肿瘤中,Bax表达下降。下调Bax能抑制多种因素诱导的多种肿瘤细胞凋亡,反之,上调 Bax则促进多种肿瘤细胞凋亡。Koshida等检测了82例胃癌,发现 Bax阳性者的凋亡指数明显低于 Bax阴性者。Sarbia等[6]对食管癌的研究显示 Bax在食管癌的表达明显低于正常食管上皮,并且随着肿瘤分化程度的下降而减低,Marx等[7]检测了 215例卵巢癌的 Bax表达情况,发现 Bax的阳性率为 47%,Bax阳性者的预后不如Bax阴性者。我们的结果和其他报道相符,同时我们发现 Bax的表达与预后关系密切,高表达预示患者的预后好,生存期长。我们推测Bax基因的检测对于结直肠癌的预后诊断有一定的参考意义。

WWOX的氨基末端有两个 WW结构域,其主要是与蛋白之间相互作用有关[8],而蛋白之间的相互作用是机体抑癌基因通过信号转导途径抑制肿瘤生长所必需的。有文献报道了WWOX通过下调凋亡抑制因子Bcl-2和 Bcl-xl及上调 P53的表达而增强 TNF的细胞毒性功能,而 TNF通过促使线粒体通透性的改变而导致了WWOX从线粒体释放入核内,起促凋亡的作用。Bax是 Bcl-2家族中最重要的促进凋亡蛋白,此次研究发现 WWOX与 Bax有协同作用 (P＜0.05),推测WWOX可能通过上调 Bax的表达等一系列相同的作用方式促进细胞的凋亡。因此联合检测两者在结直肠癌中的表达可能对其预后的诊断有着积极的作用。

[1]刘 云,李雅丽,杨 侠.WWOX基因与肿瘤的研究 [J].陕西医学杂志,2008,37(5):617-619.

[2]Park SW,Meyers JL,Zimonjic DB,et al.Frequent downregulation and loss of WWOX gene expression in human hepatocellular carcinoma[J].CancerResUK 2004,91:753-759.

[3]Aqeilan RI,Kuroki T,Pekarsky Y,et al.Loss of WWOX Expression in Gastric Carcinoma[J].Clinical Cancer Res,2004,10:3053-3058.

[4]周玉龙,徐永健,张珍祥.抑癌基因WWOX在肺腺癌细胞株 A549中表达的研究[J].中国癌症杂志,2005,15(3):234-237.

[5]Kuroki T,Yendamuri S,Trapasso F,et al.The Tumor SuppressorGene WWOX atFRA16D Is Involved in Pancreatic Carcinogenesis[J].Clin Cancer Res,2004,10(7):2459-2465.

[6]Sarbia M,Bittinger F,Grabellus F,et al.Expression of Bax,a pro-apoptotic member of the Bcl-2 family,in esophageal squamous cell carcinoma[J].Int J Cancer,1997,73(4):508-513.

[7]MarxD,BinderC,Meden H,et al.Differential expression of apoptosis associated genes bax and bcl-2 in ovarian cancer[J].Anticancer Res,1997,17(3C):2233-2240.

[8]Ludes-Meyers JH,Kil H,Bednarek AK,et al.WWOX binds the specific praline-rich ligand PPXY:identification of candidate interacting proteins[J].Oncogene,2004,23(29):5049-5055.