α-干扰素治疗 HBeAg阳性慢性乙型肝炎血清IL-17水平的动态检测

西安交通大学第一附属医院感染科(西安 710061)刘 莉 王 科 赵英仁

乙型肝炎的发病机制非常复杂,肝细胞病变主要由细胞免疫介导,T细胞激活在乙型肝炎的发病机制中起了重要作用。辅助性 T细胞 17(Helper T lymphocyte 17,Th17)是新近发现的不同于 Th1和Th2的 CD4+T细胞亚群,以主要分泌白细胞介素-17(Interleukin-17,IL-17)为特征[1]。 Th17细胞及 IL-17与炎性反应及免疫相关疾病有密切关系[2],但其在病毒感染性疾病中的作用尚不完全清楚。我们拟通过对 HBeAg阳性慢性乙型肝炎及其干扰素治疗过程中血清 IL-17进行检测,进而对其作用及意义进行评价,为进一步研究及应用奠定基础。

资料与方法

1 一般资料 选择 2008年5月至 2009年 3月我院门诊HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者20例,其中男14例 ,女 6例 ,年龄 18～ 39岁 ,平均 26.3± 0.5岁。其诊断符合 2005年中华医学会制订的《慢性乙型肝炎防治指南》[3]的命名和诊断标准。其 HBsAg阳性、HBeAg阳性病史至少6个月,3个月前血清 ALT2倍正常参考值上限(ULN),并在筛选时血清 ALT水平大于2倍且 ＜10倍 ULN,筛选时血浆 HBV DNA定量≥106U/ml。所有病例在3个月内未经免疫调节剂及抗病毒治疗、近2个月未接受保肝治疗,并排除合并其它肝炎病毒感染、酒精性肝炎等非病毒性肝炎、免疫性疾病及其他严重疾病。对照组11例均为同期健康体检者,其中男7例,女4例,年龄 20～ 38岁,平均 24.3±0.6岁。两组年龄、性别无显著性差异,具有可比性。

2 方 法

2.1 治疗及观察方法:治疗组均给予 IFN-α 1b 3MU肌注,3次 /周,疗程为 24周。在治疗前及治疗的第4周、第8周、第12周、第18周、第24周来我院观察症状、体征并检测肝功、HBeAg定量、HBV DNA含量和血清IL-17水平。在24周治疗结束时,按照2009年制定的《EASL乙肝诊治指南》疗效标准评估治疗效果。其病毒学应答标准为治疗 24周时,HBV DN A水平小于2000 U/ml;血清学应答标准为 HBeAg阳性的慢性乙肝患者发生 HBeAg血清学转换。

2.2 血清检测方法:采用双抗体夹心 ELISA法检测血清IL-17水平,试剂为R&D公司生产的人 IL-17 ELISA试剂盒(敏感度＞ 15ng/L)。目录号:D1700。试剂盒编号:Lot:263260。采用 ALYMPUS-AU5400全自动生化仪检测 ALT、AST。采用 ABI Prism 7300型荧光定量 PCR检测仪检测血清HBV DNA水平。采用德国宝灵曼公司 Elec-sys2010电化学发光全自动免疫分析仪及罗氏公司相配套的试剂盒测定 HBeAg。

3 统计学处理 应用 SPSS15.0软件对数据进行处理。计量资料用均数士标准差来表示,计数资料用率或构成比表示。各组间均值比较用t检验,所有的检验都是双侧的,P＜0.05被认为具有统计学意义。

结 果

1 治疗组治疗前血清IL-17水平分析 治疗组治疗前血清 IL-17平均水平为 1.64±0.89ng/L,健康对照组为 1.32±0.68ng/L。经统计学分析,治疗组与对照组的血清 IL-17水平差异无统计学意义。

2 治疗组各项指标变化情况 治疗组在治疗结束时按照治疗效果进行分组。其中,应答组 5例,无应答组15例。应答组HBV DNA转阴数及HBeAg阴转数分别为2例和3例 ,无应答组两者均为0例。其治疗前后 ALT、 AST、 HBeAg及 HBV DNA变化情况 ,见表 1。

表1 治疗组治疗前后 ALT、AST、HBeAg及 HBV DNA变化

经统计学分析,治疗前两组间 AL T、AST基线水平差异无统计学意义(P=0.184,P=0.089)。治疗前后 ALT变化幅度应答组平均值为 90.0±99.9U/L,而无应答组平均值为5.7±70.9U/L,两组间差异具有统计学意义(P＜0.05)。治疗前后 AST变化幅度应答组平均值为 62.2±32.8U/L,而无应答组平均值为 17.5±47.0U/L,两组间差异无统计学意义(P=0.07)。

应答组和无应答组 HBeAg定量基线水平差异具有统计学意义(P＜0.01)。应答组治疗前与治疗 24周HBeAg定量水平有差异,差异具有统计学意义(P＜0.01),而无应答组治疗前与治疗 24周 HBeAg定量水平的差异无统计学意义。

3 治疗组不同应答情况血清 IL-17水平变化情况 ,见表 2。

表2 两组患者在治疗过程中血清 IL-17水平变化

经统计学分析,治疗前两组间血清IL-17基线水平 差异无统计学意义(P=0.97),治疗 18周时两组间差异无统计学意义(P=0.055),治疗24周时两组间差异具有统计学意义(P=0.046)。

4 应答组血清 IL-17与 HBV DNA、肝功、HBeAg,见图 1～ 3。

图1 应答组血清 IL-17和 HBV DNA动态变化

图2 应答组血清IL-17与肝功动态变化

图3 应答组患者血清 IL-17与 HBeAg动态变化

5 应答组患者血清 IL-17变化,见图 4。

图4 应答组患者血清 IL-17动态变化图

图4结果显示:应答组患者血清IL-17水平在18周前无分化,而在 18周后出现明显的分化,其中患者 1、2、3在 18周时渐升高,而患者 4及 5则无变化。患者 1、2、3在治疗结束时,HBeAg均转阴,而患者 4、5则未转阴。

讨 论

近期,人们通过对实验性自身免疫性脑脊髓膜炎(EAE)、胶原诱导的自身免疫性关节炎(CIA)两种疾病小鼠模型进行研究时,提出存在一群独立于 Thl、Th2的效应性T细胞亚群-Th17细胞亚群。这群细胞由初始CD4+T细胞分化而来,同传统 Th1和Th2细胞具有明显不同的特征:其主要分泌 IL-17,具有表达控制其分化的独特的转录因子—孤独受体(Orphan nuclear receptor RORγ t),不分泌 IL-4、 IFN-γ,能介导组织炎症及自身免疫[4]。因此,在通过对小鼠以及人类的大量研究后证实初始 CD4+Th细胞接受抗原刺激后可分化为至少四种类型的 Th细胞:Thl、Th2、Th17和调节性 T细胞(Regulatory T cells,Treg),并且这些研究结果提示 Th17细胞在人类自身免疫性疾病、炎症反应的发生发展中发挥着重要的作用[5]。与 Thl主要调节细胞内病原微生物感染和 Th2调节寄生虫感染相似,Thl7/IL-17可能也具有调节某种病原微生物感染的功能,这还需要进行更深入和细致的实验研究。

在慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)病程进展中,目前研究公认 Thl/h2比例是否平衡是机体能否有效清除病毒和病毒感染细胞的主要因素之一。Th细胞亚群和细胞因子网络失衡参与了 HBV感染后多种疾病状况的发生、发展。对于新发现的 Th17细胞亚群在 HBV感染和CHB疾病的病理进程以及与其所致的肝脏炎性损伤中发挥的作用目前仅有少量的文献报道。日本 Yuki Yasumi等[6]报道,急性重型及暴发型肝损伤较急性普通型肝损伤血清IL-17升高,而急性普通型肝损伤与与正常人相比无差异,血清IL-17水平与急性暴发型肝损伤的凝血酶原活动度相关。国内邢直直等[7]报道,慢性乙型肝炎血清 IL-17水平高于于正常人,且与肝脏炎症及纤维化程度相关。我们的研究表明接受干扰素治疗的 HBeAg阳性慢性乙肝患者血清IL-17较健康人无明显升高,其原因可能为:所选患者其肝功多为轻度损害,此阶段机体的免疫反应很弱,Th17细胞在外周血 CD4+T细胞所占比例并不高,故其产生的 IL-17可能在血清中的水平非常低,直接对体内状况进行检测时,并不能检测到其微弱的变化情况。

目前有效抗乙肝病毒治疗的方法大致分为以拉米呋啶为代表的核苷类似物和以α-干扰素(Interferon alpha,IFN-α)为主的免疫分子治疗两大类。α-干扰素因其直接抗病毒和免疫调节的双重作用在用于临床 20余年来一直是治疗乙肝的一线药物之一。研究表明α-干扰素是唯一一种经过对照研究证实的能降低和清除慢性乙肝患者HBV感染(将HBsAg转换为抗HBs,5%～ 8%)的药物。在本研究显示:HBeAg阳性慢性乙肝患者干扰素治疗过程中,应答组 HBV DNA曲线呈总体下降趋势,其中在 4周时可见明显下降趋势,4周后曲线呈缓慢下降趋势。无应答组 HBV DNA变化则无下降趋势,而是在基线水平小幅度波动;应答组 ALT、AST在 4周时则有明显上升,4周后曲线呈迅速下降趋势;而应答组 HBeAg定量曲线为下降趋势,HBeAg定量曲线 12周前于基线水平波动,无明显下降,12周后呈明显下降趋势。其 ALT、AST、HBV DNA及HBeAg变化情况与α-干扰素在不同时期的不同抗病毒机制有关。第一期病毒水平较快下降,主要是经细胞产生抗病毒蛋白,这些效应分子通过抑制病毒 mRNA表达、RNA编辑、抑制病毒 RNA合成或引发病毒RNA降解实现抗病毒作用[8]。 ALT、AST迅速上升,可能反映免疫系统被激活而破坏感染的肝细胞。IFNα增强M HC-Ⅰ的表达,从而优化病毒抗原(核壳蛋白成分)在肝细胞表面的展现。已被病毒抗原激活的特异CT L,因病毒抗原的吸引而汇集于会内,识别同时提呈的M HC-Ⅰ和病毒核壳肽,从而破坏感染的肝细胞。同时外周血NK活性降低,可能由于NK细胞也进入肝内参与细胞毒作用。而IFNα治疗的最初数小时内MHC-Ⅰ糖蛋白即出现在肝细胞膜上,而 ALT则在以后的 5～ 8周才从治疗前水平上升,提示清除感染肝细胞不仅需要表达其靶性(M HC-Ⅰ ),还需随时间发生的其他免疫学改变。第二期病毒水平缓慢下降,相当于免疫调节效应。干扰素通过增强细胞膜上的 HLA表达,增强其他免疫杀伤细胞的功能,增强巨噬细胞的分化和增殖,提高巨噬细胞的吞噬功能和细胞毒活性,杀伤病毒感染细胞而清除病毒,调节机体对乙肝病毒的免疫应答,在肝内产生大量 Th1型细胞因子,IL-2和 IL-12诱导内源性 IFNγ和TNF α,IFNγ和 TNFα可在肝细胞无损伤过程中清除病毒[9]。使得细胞内的病毒得以清除,从而 HBeAg的生成也随之减少;与此同时,由于体液免疫的作用,机体会不断产生抗-HBe,随着 HBeAg的减少和抗-HBe的增多,机体则发生血清学的转化。

本研究表明应答组血清IL-17曲线为上升趋势,在18周前于基线水平波动,无明显上升,18周后呈明显上升趋势;且在HBeAg转阴者中升高更明显。提示IL-17可能在α-干扰素治疗的第二个阶段参与病毒的清除,并与其它细胞因子相互作用,充分激发免疫,以抑制感染肝细胞内的病毒复制,增强复制病毒的清除,达到持久抑制病毒复制和表达。进一步阐明其作用及机制对于进一步提高干扰素治疗效果有深远的意义。

综上所述,IL-17作为一种细胞因子,可能参与了干扰素抗病毒的后期的免疫调节作用,并很有可能在后期持久抗病毒中发挥重要作用。但由于慢性乙肝病毒感染的特殊性、机体免疫反应的复杂性,干扰素作用机理的多样性,Th17细胞分泌 IL-17体内分布的不平衡性,IL-17在 HBV感染者体内复杂的免疫系统中扮演的角色仍需我们进一步探索。

[1]Infante-Duarte C,Horton HF,Byrne M C,et al.Microbial lipopeptides induce the production of IL-17 in Th cells[J].JImmunol,2000,165(11):6107-6115.

[2]Chen Z,Laurence A,Kanno Y,et al.Selective regulatory function of Socs3 in the formation of IL-17-secreting T cells[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2006,103(21):8137-8142.

[3]中华医学会肝病学分会,中华医学会感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南 [J].中华传染病杂志,2005,23(6):421-431.

[4]Harrington LE,Hatton RD,Mangan PR,et al.Interleukin17-producing CD4+effector T cells develop via a line μ ge distinct from the T helper type 1 and 2 lineages[J].Nat Immunol,2005,6(11):1123-1132.

[5]Afzail G,Lombardi RI,Lechler and Lord GM.The role of helper 17(Th17)and r μgulatory T cells(Treg)in human o μgan transplantation and atuoimmune disease[J].Clin and Expe Immunol.2007,148(1):32-46.

[6]Yasumi Y,Takikawa Y,Endo R,et al.Interleukin-17 as a new marker of severity of acute hepatic injury[J].Hepatol Res,2007,37(4):248-254.

[7]邢直直,杜文军,陈士俊.辅助性 T淋巴细胞 1、2、17在慢性乙型肝炎病毒感染状态中的变化[J].中华传染病杂志,2008,26(3):158-162.

[8]Kalvakolanu DV. Alternate interferon signaling pathways[J].Pharmacol Ther,2003,100(1):1-29.

[9]姜凤良,张 洁,田明昆 ,等.乙肝病毒感染者血清 IL-2、IL-4、TNF-α的检测及临床意义 [J].陕西医学杂志,2007,36(3):322-323.