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月经周期雌激素变化对外周血CD4+CD25+调节性T细胞水平的影响

2010-06-30王巧玲罗蒲英熊员焕

实用临床医学 2010年7期
关键词:管中离心机月经周期

王巧玲,罗蒲英,熊员焕

(1.南昌大学研究生院医学部2007级;2.江西省人民医院妇产科,南昌330006)

CD4+CD25+调节性 T细胞(regulatory T cell,Treg细胞)在维持自身免疫耐受中发挥着重要作用,它的缺失会导致自身免疫性疾病的发生。但是这种细胞的调节因素现在还不是很清楚,大量研究发现雌激素可以促进T reg细胞的增殖[1]。最近Huber S.A.[2]发现转基因雌鼠在动情期感染柯萨奇病毒(CVB3)后其外周血中 Treg细胞比在其他时期感染时明显增加,同时还发现给外源性17-β雌二醇予雌性小鼠可以保护它们感染CVB3后不罹患心肌炎,同时体内的 Treg细胞也大量增加。这些研究说明小鼠动情周期中雌激素的变化可以影响T reg细胞。本研究旨在探讨人体雌激素的变化对T reg细胞水平的影响,以阐明雌激素对机体免疫功能影响的分子机制,并为雌激素作为免疫调节治疗自身免疫性疾病新方法的探索提供依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选择2009年10-12月江西省人民医院体检中心正常育龄女性20例,年龄 25~30岁,平均26.35岁。月经周期28~30 d。

1.2 主要试剂与仪器

红细胞裂解液、PBS缓冲液(美国BD公司),FITC anti-human CD4、PE anti-human CD25、同型阴性对照抗体(美国eBioscience公司),碘[125I]雌二醇放射免疫分析药盒(天津九鼎医学生物工程有限公司)。Beckman coulter XL流式细胞分析仪(美国Bekman Coulter公司),XK96-A快速混匀器(姜堰市新康医疗器械厂),普通冰箱(中国海尔),LD4-2低转速离心机(北京医用离心机厂),GC-1200γ-放射免疫计数器(科大创新股份有限公司),电热恒温水温箱(上海医疗器械厂),KDC-2046低速冷冻离心机(科大创新股份有限公司)。

1.3 方法

分别于月经周期第 3、8、13、18、23天采集外周静脉血。

1.3.1 标本采集

于清晨 8:00~9:00空腹采取外周静脉血5 mL,其中2 mL置于EDTA抗凝管中混匀,2 h内检测Treg细胞水平;3 mL置于普通管中,4 h内检测雌激素。

1.3.2 流式细胞术分析Treg细胞

用 10 μ L 移 液器分别取 FITC-抗 CD4 、PE-抗CD25 20 μ L 加入清洁试管 ;用 100 μ L 移液器向上管加入100 μ L抗凝全血,并充分混匀,同时设同型阴性对照管;室温避光孵育20 min;加入300 μ L红细胞裂解液,并用微型混合器震荡5 s;室温避光孵育15 min,待红细胞充分裂解;低转速离心机以1 400 r◦min-1离心 5 min,弃上清液;PBS缓冲液1 mL洗涤1次;加入缓冲液400 μ L重新悬浮细胞;上流式细胞仪检测,Flowjo v 7.6流式分析软件分析Treg细胞占外周血CD4+T细胞的百分比。

1.3.3 放射免疫法(RIA)测定外周血清雌激素水平

低转速离心机以1 400 r◦min-1离心5 min,分离血清;NSB管中加入“0”浓度标准品、标记物及蒸馏水各 200 μ L;各浓度(0 、10 、50、100、250 、750、2 000 ng◦L-1)标准管中分别加入相应浓度标准品、标记物、抗体各 200 μ L;标本管中加入血清、标记物、抗体各200 μ L;充分混匀后置于37℃水温箱1.5 h;各管中加入分离剂1 000 μ L;充分混匀,4 ℃3 600 r◦min-1离心20 min,弃上清液;各管按次序放置于Υ-放射免疫计数器测量架上,设定参数,配套电脑自动分析雌激素水平。

1.4 统计学方法

2 结果

1) 20例正常女性外周血中雌激素水平呈现周期性变化,于月经周期第13天水平最高,显著高于第 3、8、18、23天水平(P<0.05);第 3天水平最低,显著低于第8、13、18、23天水平(P <0.05)。而外周血Treg细胞也随雌激素水平变化呈现周期性波动,于月经周期第13天水平最高,显著高于第3、8、18、23天水平(P <0.05);第3天水平最低,显著低于第8、13、18、23天水平(P <0.05)。外周血雌激素和T reg细胞水平月经周期第8天与第18天比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1 月经周期中Treg细胞水平及雌激素水平变化的比较

表1 月经周期中Treg细胞水平及雌激素水平变化的比较

检测指标 第3天 第8天 第13天 第18天 第23天Treg细胞/% 11.27±1.23 13.52±1.64 20.72±2.24 14.38±1.45 17.33±1.40雌激素水平/(ng◦ L-1) 37.90±8.94 93.09±11.86 204.27±24.01 105.47±14.45 171.68±19.21

2) 取月经周期第13天外周血雌激素水平及T reg细胞水平进行pearson相关分析,发现 Treg细胞与雌激素水平呈正相关(r=0.615,P<0.005)。

3 讨论

在我国,自身免疫性疾病发病率高、病程长,且预后不佳。其中结缔组织病和神经肌肉疾病还有较高的致残率。近年来,自身免疫性疾病发病率呈逐渐上升趋势,而在治疗上以应用激素和免疫抑制剂短期缓解症状为主,效果不佳且不良反应明显。因而寻找新的有效的治疗方法倍受重视。

1995年Sakaguchi S.等[3]发现将 CD4+T细胞中的CD25+细胞剔除后即CD4+CD25-T细胞接种到裸鼠中结果导致裸鼠都发生了自身免疫性疾病,包括甲状腺炎、胃炎、多关节炎等,而在接种后一定时间内注入Treg细胞可以抑制这些自身免疫性疾病的发生,表明 Treg细胞可抑制自身免疫性疾病的发生。此后的研究表明Treg细胞在外周免疫耐受中发挥重要作用[4],并在自身免疫性疾病中发挥着重要作用。研究还发现雌激素与T reg细胞的关系密切,有学者发现生理剂量的雌二醇(E2)可以促使小鼠CD4+CD25-T细胞向T reg细胞转化,使不同组织中的Treg细胞增加[5]。

本研究也证实了在女性月经周期中T reg细胞随着体内雌激素的变化而出现波动,据此推测在女性体内是否因为T reg细胞的波动引起免疫内环境的不稳定状态,最终引起自身免疫耐受功能异常,导致自身免疫性疾病的发生。这也可以解释一些临床现象,如:多发性硬化症(MS)女性发病明显高于男性,女性从月经初潮起,MS的发病率逐渐增加,到绝经期达到高峰。笔者认为雌激素可以通过调节T reg细胞而在自身免疫性疾病的发生中起了一定的作用。

在动物实验中,发现在小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型诱导期口服乙烯雌酚可以抑制EAE的发展[6]。后来的研究发现在MS的动物模型EAE诱导期给予低剂量的E2(剂量在妊娠水平与动情期水平之间)皮下注射,可以显著抑制不同种系小鼠疾病的发展[7]。Huber S.A.[2]给外源性17-雌二醇予雌性小鼠可以保护它们感染CVB3后不罹患心肌炎,而且体内的T reg细胞也升高,这给笔者一些提示,是否可以将雌激素作为治疗自身免疫性疾病的一个新的突破口?笔者将继续进行系列研究,为雌激素作为免疫调节治疗的新方法提供依据。

[1] Polanczyk M J,Hopke C,Huan J,et al.Enhanced Fox P3 expression and T reg cell function in pregnant and estrogen-treated mice[J].Neuroimmunol,2005,170(12):85-92.

[2] Huber S A.Cox sackievirus B3-induced muocarditis:infection of females during the estrus phase of the ovarian cycle leads to activation of T regulatory cells[J].Virology,2008,378(2):292-298.

[3] Sakaguchi S,Sakaguchi N,Asano M,et al.Immunologic selftolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 recepto r alpha-chains(CD25).Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune disease[J].J Immunol 1995,155(3):1151-1164.

[4] Stephens L A,Barclay A N,Mason D.Phenotypic characterization of regulatory CD4+CD25+T cells in rats[J].Int Immunol,2004,16(2):365-375.

[5] Tai P,Wang J,Jin H,et al.Induction of regulatory T cells by physiological level estrogen[J].Cell Physiol,2008,214(2):456-464.

[6] Bebo B F Jr,Fyfe johnson A,Adlard K,et al.Low-dose estrogen therapy ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis in two different inbred mouse strains[J].J Immunol,2001,166(3):2080-2089.

[7] Polanczyk M J,Hopke C,Vandenbark A A,et al.Estrogen-mediated innunomodulation involves reduced activation of effecto r T cells,potentiation of Treg cells,and enhanced espression of the PD-1 costimulatory pathway[J].Neurosci Res,2006,84(2):370-378.

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