改良硝酸脱钙方法的研究及应用

刘宪军 陈萍 徐林娜

在常规的病理技术工作中，经常会遇到骨、牙齿及其他钙化组织需要做石蜡切片及苏木素-伊红（HE）染色，做一张好切片，难度很大。优良的脱钙是做好石蜡切片及病理正确诊断的保证。硝酸是病理科最常用的脱钙剂之一，它是借助使组织软化并达到一定硬度后再做石蜡切片的一种方法。脱钙的质量受多种因素影响，硝酸的浓度、温度是脱钙效果的关键。我们根据微波(microwave,MW)辐射效应的原理[1-3]，选用了“低温微波-硝酸快速脱钙”方法对骨、牙齿及其他钙化组织进行脱钙，在HE染色实际应用中获得了良好效果[4-6]。

1 材料与方法

1.1 材料 吉林市中心医院病理科2006～2009年50例骨组织。JDIII型医用微波炉。硝酸试剂为北京化工厂生产。

1.2 方法 将骨组织锯成大小为1.5cm×1.5cm×0.15cm，用10%甲醛固定24h，流水冲洗15min～lh。实验组采用“低温微波-硝酸快速脱钙”方法脱钙，首先将硝酸在冰箱中预冷保持10℃，硝酸脱钙液的浓度10%。(1)在1000ml的大烧杯内放500ml冰水。(2)在500ml的小烧杯内放250ml经冰箱预冷的10%硝酸脱钙液，然后放待脱钙的组织。(3)将小烧杯放入大烧杯内，然后一同放入微波炉中。(4)250W脱钙,并测量大、小烧杯中液体的温度。当接近10℃时，向大烧杯中添加冰块，或向小烧杯中添加预冷的脱钙液，这样脱钙液温度不会迅速升高,又发挥了微波效应，保证了脱钙液的温度始终控制在15℃以内，脱钙时间骨密质需要50～55min,骨松质需要30～35min[7]。对照组采用室温(20℃)硝酸,硝酸脱钙液的浓度10%，脱钙时间骨密质需要24～36h,骨松质需要12～24h，脱钙后自来水冲洗4～6h[7]。实验组和对照组脱钙后，常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋，连续切片数张，厚4μm，65℃烤片3h。将切片进行HE染色，对比观察。

2 结果

图1 HE×100

图2 HE×100

实验组中的骨组织及钙化组织经低温微波-硝酸快速脱钙方法过程处理后，一般可切出一张完整甚至连续、令人满意的切片，HE染色后，显微镜下细胞核与细胞质结构清晰，红蓝相间，色彩鲜艳（图1），从切片质量和染色等方面都明显优于对照组。对照组中的骨组织及钙化的组织经室温(20℃)硝酸脱钙液处理后，切片时刀片易产生缺口，制片不成型，厚薄不均，即使勉强切出片，质量也很差，染色时易脱片，显微镜下细胞核不着蓝色，而是与细胞质等均为红色，呈一片红染(图2)。所有这些都给病理医生的诊断带来困难。

3 讨论

对骨及含钙组织进行组织学观察研究时，组织切片的制作是关键。但由于骨及含钙组织硬，如果脱钙不彻底可导致切片破碎甚至无法切片，因此组织制片前选择合适的脱钙液就显得尤为重要。通常使用10%的硝酸水溶液对骨组织脱钙，使骨组织中钙盐溶解于其中，然后用流水冲洗标本，需要的时间长，脱钙不彻底，致使骨组织硬，难于得到完整的切片，即使勉强切出片，质量也很差，染色时易脱片。如果经过长时间脱钙液处理后的组织，酸性太强，HE染色，显微镜下观察细胞核不易着蓝色，与细胞质均为红色，呈一片红染，分不清细胞核的结构，所有这些切片都会给病理医生的诊断带来困难。根据实际工作经验，认为不能切出完整的切片，是因为脱钙不彻底，组织过硬。HE染色不佳，是脱钙液作用时间长，标本呈酸性，这些直接影响着染色效果，使细胞核、细胞质等均染为红色。针对这些问题，为了得到一张高质量的含钙组织的HE切片，经过多种硝酸脱钙方法的实验及处理，不断摸索总结，从2006年至今，一共有50多例骨组织，使用低温微波-硝酸快速脱钙方法脱钙，此种方法脱钙液对骨组织的渗透力强，作用时间短，对组织的结构损坏小，可以迅速和方便地软化硬韧的骨组织、牙齿及其他钙化组织，易于切取较好的组织切片，又能更好保存细胞结构，解决标本因浸泡脱钙液时间过长，而使细胞核难于着色的问题，得到满意的结果。这种脱钙方法，不仅操作简单，而且经济实用，效果满意，值得推广，对常规HE制片极其重要。经多次实验，无论切片的质量，还是HE染色效果，此方法优于常规硝酸脱钙处理的方法，提高了切片与染色的质量，最大程度地保存了细胞内蛋白质及酶等的结构，这对肿瘤的鉴别诊断，进一步做免疫组织化学染色及酶染色非常重要[8]，而且提高诊断的质量和缩短发报告的时间。

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[8]熊正文,朱光君,李春光,等.提高骨组织免疫组织化学染色质量的若干问题探讨[J].中国组织化学与细胞化学杂志,2002,11：105.