宫颈病变患者S H P-2与CD4+T表达意义的研究

孟斐

SHP-2是蛋白酪氨酸磷酸酶家族(protein tyrosine phosphatases, PTPase)中的一员。SHP-2是由PTPN11基因所编码的一种蛋白酪氨酸磷酸酶，它广泛表达于哺乳动物机体的各种组织和细胞中，在胚胎发育、血细胞生成及多种生长因子的信号转导机制中起到了重要的作用。许多研究表明SHP-2的突变与多种人类肿瘤的发生有密切关系。近年来关于SHP-2在免疫反应过程中的调节作用逐渐受到重视，许多研究证实了其与免疫反应相关的细胞因子及细胞信号转导系统的密切关系。SHP-2在患者血液中的表达情况还不为我们所知，SHP-2在患者血液中参与宫颈癌发生的免疫机制仍然不清楚。本研究拟探讨SHP-2与CD4+T在患者血液中的表达情况及相互关系。

1 材料与方法

1.1 材料 主要试剂：人淋巴细胞分离液(天津灏洋)；Rabbit SH-PTP2(C-18)(Santa Cruz)；monoclonal mouse Anti-GAPDH(KANG CHEN)；Goat Anti-Mouse/Rabbit IgG-HRP二抗(康为试剂)；ECL蛋白发光试剂盒(Pierce)；红细胞裂解液和Mouse Anti-Human CD4(北京四正柏)。

1.2 实验方法

1.2.1 样本选择 选择沈阳医学院奉天医院2007年6月～2010年1月妇产科住院患者进入本研究。45例宫颈癌(Ⅰ～Ⅲ期)患者，年龄从30岁到70岁，平均年龄48岁。32例宫颈上皮内瘤变(CIN)患者(Ⅰ～Ⅱ)，年龄从30岁到60岁，平均年龄42岁。14例正常宫颈患者，年龄从30岁到62岁，平均年龄45岁。取材前均未接受任何治疗。宫颈组织诊断在奉天医院病理科。

1.2.2 Ficoll分层液分离人外周血淋巴细胞 取上述三组患者的新鲜抗凝血2ml，与生理盐水1：1混匀后，小心加于2ml的淋巴细胞分离液之液面上，以1500转/分离心(室温平转，半径15cm)15分钟，离心管中由上至下细胞分四层。取第二层细胞，加入到含4～5ml生理盐水的试管中充分混匀后以3000转/分离心(室温平转，半径15cm)25分钟，取沉淀，去上清。再重复上述步骤一次。收起沉淀加入到1.5ml EP中，再加1ml生理盐水，混匀后以12000g/min离心15分钟，4℃。取沉淀，去上清，于-70℃冰箱保存，标记。

1.2.3 Western blot方法检测人外周血淋巴细胞中SHP-2蛋白的表达 收集Ficoll分层液分离获得的人外周血单个核细胞，分别进行如下操作：细胞的裂解、蛋白质定量(Bradford法)、蛋白样品制备及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、封闭、杂交、ECL反应。

1.2.4 流式细胞仪检测人外周血CD4+T的表达 取100ul人抗凝外周血加入5ml流式管底；10ul CD4+抗体加入流式管底与全血混匀，室温避光孵育20分钟；加入2ml 1×红细胞裂解液混匀后避光放置10分钟，溶解红细胞；将样品管1500rpm离心10分钟，弃上清；加入2ml PBS洗液重悬细胞，1500rpm离心10分钟，弃上清；加入0.5ml PBS洗液重悬细胞后流式细胞仪检测。

2 统计分析

使用SPSS13.0统计软件进行统计分析。SHP-2及CD+T在子宫颈癌，CIN及正常宫颈患者血中的表达差异用方差分析，P＜0.05有统计学意义。

3 实验结果

3.1 SHP-2蛋白在宫颈癌、CIN、正常宫颈患者外周血的表达结果 由western blot影像可以看出正常宫颈患者蛋白的条带显影浅，CIN患者蛋白的条带显影加深，而宫颈癌患者蛋白的条带显影非常深。提示SHP-2在宫颈癌组高表达，(图1所示)。

图1 SHP-2蛋白在宫颈癌、CIN、正常宫颈患者外周血的表达

表1 SHP-2蛋白在不同患者血中的表达结果

表2 CD4+T在不同患者血中的表达结果

通过统计学分析可知：宫颈癌组与正常宫颈组间有显著差异，差异有统计学意义(q＝4.331,p＜0.05)；宫颈癌组与CIN组间有显著差异，差异有统计学意义(q＝3.602,p＜0.05)；CIN组与正常宫颈组间无显著差异，差异无统计学意义(q＝0.431,p＞0.05)。

3.2 CD4+T在宫颈癌、CIN、正常宫颈患者外周血的表达结果 CD4+T在宫颈癌组低表达，通过统计学分析可知：宫颈癌组与正常宫颈组间有显著差异，差异有统计学意义(q＝7.927,p＜0.05)；宫颈癌组与CIN组间有显著差异，差异有统计学意义(q＝6.712,p＜0.05)；CIN组与正常宫颈组间无显著差异，差异无统计学意义(q＝1.397,p＞0.05)。

4 讨论

T淋巴细胞是机体免疫系统内功能最重要的一大细胞群。T细胞介导的细胞免疫反应在杀伤肿瘤细胞、控制肿瘤生长中起重要作用，T细胞有两个亚群,分别表达CD4+和CD8+，CD4+细胞在免疫应答中发挥重要作用,且有重要的记忆功能,协调B细胞分化产生抗体。近年来SHP-2在免疫反应中的调节作用逐渐受到重视，SHP-2在T细胞中的生物学作用通过转基因老鼠实验得到证实，这些研究证实SHP-2负调控T细胞的激活，同时也调控T细胞的生物学活性。以前的研究显示SHP-2是TCR信号传导通路中的负调控因子[1]，在缺失GAB2的老鼠TCR介导的T细胞增殖被加强，在这个过程中SHP-2发挥了调节作用[2-3]。由本实验结果可知：血液中SHP-2的表达在宫颈癌组明显高于CIN组与正常宫颈组，差异有统计学意义；CIN组与正常宫颈组间差异无统计学意义。血液中CD4+T的表达在宫颈癌组明显低于CIN组与正常宫颈组，差异有统计学意义；CIN组与正常宫颈组间差异无统计学意义。这表明随着宫颈病情从良性到恶性的转变，血液中SHP-2表达的值升高，同时伴随着血液中CD4+T的降低。这也从患者血液水平证实了前面所陈述的推断。恶性肿瘤的发生机制涉及很多方面，免疫机制是目前研究的新热点。可以认为，免疫系统激活后，易感个体和有抗性个体开启了免疫系统中不同的基因或者是同种基因的表达产生了差异而造成了结局不同[4-6]。我们的实验结果证实宫颈癌患者SHP-2高表达的同时CD4+T低表达，从免疫机制解释了宫颈癌发生的机理。安华章等[7]发现：SHP-2是免疫系统的“刹车蛋白”，它在免疫反应中起负向调控作用。这一发现为免疫反应的调节机制增添了新的认识，同时提示“SHP-2”有可能成为免疫治疗的新靶点。随着科研的深入，此类天然“刹车”可“人工制造”，无疑将在免疫治疗中发挥巨大作用。

[1]Robert 3,Greyeny Huyer,Anastaina Kotsoni,et al.The src homology 2 domain-containing tyrosine phosphatase 2 regulates primary T-dependent immune responses and Th cell differentiation[J].J.Immunol,2005,175：6498-6508.

[2]Yamasaki,S.et al.Gads/Grb2-mediated association with LAT is critical for the inhibitory function of Gab2 in Tcells.Mol[J].The American Association of Immanologists.2003,23,2515-2529.

[3]Yamasaki S.Docking protein Gab2 is phosphorylated by ZAP-70 and negatively regulates T cell receptor signaling by recruitment of inhibitory molecules[J].J. Biol.Chem,2001,276,45175-45183.

[4]Du Z.Inhibition of IFN-a signaling by a PKC-and protein tyrosine phosphatase SHP-2-dependent pathway[J].Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A,2005,102,10267-10272.

[5]Yu WM,Daino H,Chen J,et al.Effect s of a leukemia 2 associated gain of function mutation of SHP-2 phosphatase on interleukin23 signaling[J].J Biol Chem,2006,281(9)：5426-5434.

[6]Du Z,Shen Y,Yang W,et al.Inhibition of IFN-alpha signaling by a PKC-and protein tyrosine phosphatase SHP-2-dependent pathway[J].Proc Natl Acad Sci USA,2005,102(29)：10267-10272.

[7]Huazhang An,Wei Zhao,Jin Hou,et al.SHP-2 phosphatase negatively regulates the TRIF adaptor protein-depent type Ιinterferon and proinflammatory cytokine production[J].Immunity,2006,25(6)：919-928.