枸杞多糖对人外周血巨噬细胞活性的影响

许忠新，单铁英，苏安英，杨书良

（河北工程大学医学院：1.人体解剖学与组织胚胎学系；2.病理学系，邯郸056002）

枸杞多糖（lycium bararum polysaccharides，LBP）是传统中药材枸杞的主要成分之一，由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖等6种单糖组成。有研究证明，多糖成分（如云菇多糖、灵芝多糖等）可通过激活机体免疫系统来达到抗肿瘤目的［1－5］。对于LBP抑制肿瘤的免疫调节作用及免疫机制尚不十分清楚。本文主要以LBP为材料研究其对人外周血巨噬细胞免疫调节作用，为进一步开发免疫增强剂的抗肿瘤药物提供参考。

1 材料与方法

1.1材料 健康人外周血采自20～30岁健康志愿者。人肝癌细胞株Bel－7402由作者提供。LBP由本校实验中心从宁夏优质枸杞子中分离提取。人重组白介素－2（rIL－2）购自美国Peprotech公司。RPMI－1640为Gibco公司产品。MTT试剂均为Sigma公司产品。肿瘤坏死因子－α（TNF－α）、ELISA试剂盒购自晶美生物工程有限公司。淋巴细胞分离液为上海生化试剂二厂产品。胎牛血清（FBS）为杭州四季青公司产品。

1.2分离人外周血单核细胞（PBMC）无菌采取健康人外周血约5mL，予肝素抗凝，加入等体积磷酸盐缓冲液（PBS）混匀，用淋巴细胞分离液经密度梯度离心法分离外周血PBMC［6］，取白细胞层用PBS洗涤2次，加入含10%FBS的RPMI－1640培养基，置于饱和湿度、37℃、5%CO2培养箱中培养2h，贴壁细胞作为巨噬细胞。

1.3分析巨噬细胞吞噬作用和测定细胞因子分泌 将培养的巨噬细胞用RPMI－1640培养基调整细胞浓度为2.5×106个/mL，接种于96孔培养板中，每孔80μL，实验孔分别加入20 μL对照剂（培养基及20μg/mL rIL－2）和不同浓度（50、60、80、100μg/mL）LBP，培养24h后分别加入Bel－7402细胞悬液（1×105个/mL）100μL，使效、靶比为20∶1。每孔液体终体积为200μL，不足者用培养基补齐，每组均设4个复孔。置于饱和湿度、37℃、5%CO2培养箱中培养48h后进行如下处理：（1）取各组培养上清液100μL，用ELISA测定TNF－α水平；（2）各孔加 MTT（5mg/mL）20μL，培养过夜，离心弃去培养上清液，每孔加入DMSO 150μL，混匀后以测定波长为492nm、参比波长为620nm检测各孔A值，并计算对肿瘤细胞的抑制率。抑制率＝［1－（肿瘤细胞与巨噬细胞混合孔A值－巨噬细胞孔A值）/肿瘤细胞孔A值］×100%。

1.4统计学方法 采用SPSS11.5统计软件进行单因素方差分析和LSD，实验结果以s表示。

2 结 果

2.1LBP对人外周血巨噬细胞吞噬作用的影响 经不同浓度LBP作用72h后巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用明显增强（P＜0.01），80、100μg/mL LBP刺激后巨噬细胞的吞噬作用明显大于rIL－2组（P＜0.01），见表1。

表1 LBP对人外周血巨噬细胞吞噬作用的影响（n＝4）

2.2LBP对人外周血巨噬细胞TNF－α的影响 经不同浓度LBP作用72h后LBP组肿瘤细胞与巨噬细胞培养上清液中TNF－α水平明显增高（P＜0.01），80、100μg/mL LBP组肿瘤细胞与巨噬细胞培养上清液中TNF－α量与对照组比较明显增高（P＜0.01），但80、100μg/mL LBP组与rIL－2组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见图1。

图1 LBP对人外周血巨噬细胞TNF－α的影响（n＝6）。

3 讨 论

肿瘤患者在接受放、化疗时射线和药物对机体的免疫系统有抑制作用，致使机体免疫功能进一步下降，影响了治疗效果并可导致一些不良反应，所以解决肿瘤患者免疫功能低下问题成为肿瘤治疗的非常关键的环节。最近国内外学者提出生物反应调节剂（biological responsemodifier，BRM）的概念，强调在肿瘤放、化疗及手术治疗同时应用BRM，不但能提高患者免疫功能，还可减轻上述治疗对免疫系统及造血系统的损害，从而提高治疗效果。在我国，中药取自天然，来源广泛，容易获得，不良反应小，因此从中药中提取有效成分作为BRM显示出明显优势。LBP具有很好的免疫促进作用，为进一步研究其作用机制，本文研究了LBP对外周血巨噬细胞增殖及功能的影响。

TNF－α能够直接杀死病毒和肿瘤，最近文献指出，TNF－α在CD8＋T细胞的成熟阶段发挥重要的信号作用，TNF－α缺乏时会导致效应性CD8＋T细胞产生下降，影响其转化为记忆性T细胞［7］。可见TNF－α除了对肿瘤细胞具有直接毒性和生长抑制作用外，还可以通过增强CD8＋T细胞的细胞毒作用抵抗肿瘤生长。

本研究结果显示，在50～100μg/mL浓度下LBP可明显提高巨噬细胞对肿瘤细胞的杀伤功能，并增强巨噬细胞TNF－α的分泌。提示LBP除可以直接增强巨噬细胞吞噬功能外，还可能通过促进巨噬细胞分泌TNF－α来间接杀伤肿瘤细胞。

本研究结果证实，LBP能够增强巨噬细胞对肿瘤细胞的杀伤功能。LBP可作为BRM发挥免疫调节功能而增强抗肿瘤作用，但其具体的作用机制尚需进一步研究证实。

［1］何燕，吴雄志.中药多糖的免疫调节作用［J］.四川中医，2001，2（19）：15.

［2］古赛，蒋小黎.枸杞多糖治疗酒精性脂肪肝大鼠的实验研究［J］.重庆医学，2007，36（1）：60.

［3］方晓松，周颦.注射用黄芪多糖治疗原发性肝癌的疗效观察［J］.重庆医学，2009，38（8）：935.

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［5］王宝金，赵轩.子宫腺肌病患者组织中巨噬细胞的检测［J］.医药论坛，2009，30（3）：15.

［6］巴德年.当代免疫学技术与应用［M］.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998.

［7］Shi M，Umeshappa KS.Alpha tumor necrosis factor contributes to CD8＋ T cell survival in the transition phase［J］.Biochem Biophys Res Commun，2007，360（3）：702.