PKD3上调HEK293中uPAR的表达及机制＊

邹志鹏，冯 丽，许万福，邓 凡

（南方医科大学细胞生物学教研室，广州510515）

蛋白激酶D（protein kinase D，PKD）属于一类新的结合二酰基甘油（DAG）和佛波脂（PMA）的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，目前已鉴定出3种PKD亚型（PKD1、2、3），分别参与细胞高尔基体反面膜转运、细胞存活、迁移、细胞分化、细胞增殖和凋亡等多种细胞功能的调节［1－2］。PKD1在低侵袭型前列腺癌细胞LNCaP中表达水平较高，不仅如此PKD1可磷酸化E－钙粘素（E－Cadherin），从而增强LNCaP的聚集，减弱其迁移能力［3］。作者最近的研究显示，在高侵袭型前列腺癌细胞PC－3中PKD3的表达水平明显高于LNCaP，在LNCaP中过表达PKD3可抑制PMA诱导的细胞凋亡，并促进细胞从G1期向S期转换；反之敲低（knockdown）PC－3中的内源性PKD3可促进细胞凋亡，也可导致 G0～1期阻滞，从而抑制 PC－3增殖［4］。而在非小细胞肺癌A549中PKD3可通过基质金属蛋白酶－2（MMP－2）促进肿瘤的迁移（尚未发表）。提示PKD3可能通过不同的机制而促进细胞的迁移、侵袭。

尿激酶型纤溶酶原激活物受体（urokinase－type plasminogen activator receptor，uPAR）隶属于Ly－6蛋白超家族，与其配体uPA前体结合后导致uPA的激活，从而切割纤溶酶原产生有活性的纤维蛋白溶酶，继而降解细胞外基质，同时激活一系列 MMP－2，如 MMP－3、MMP－9及 MMP－13，在肿瘤的迁移、侵袭和转移中起重要作用［5－6］。uPAR的表达受多种转录因子如AP1、HIF1－alpha及SP1调控，同时有研究表明，β－连环蛋白－TCF4信号通路可通过AP1间接上调结肠癌细胞中uPAR的表达［7］。

尽管PKD3与uPAR均可促进肿瘤的迁移，但肿瘤迁移和侵袭中PKD3及uPAR的相互调控关系尚未阐明。本研究拟以人胚肾上皮细胞系HEK293为研究模型，探求PKD3对于uPAR的调控作用及其初步机制，为阐明PKD3调控细胞迁移及肿瘤迁移和侵袭的机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料 DMEM液体培养基以及胎牛血清购自Hyclone，转染试剂 Hilymax购自日本同仁化工，丙烯酰胺、SDS、CHPAS及甘氨酸等超纯生化试剂均购自美国Promega公司，焦磷酸钠、氟化钠和钒酸钠购自Sigma，pEGFP－C2、pEGFPPKD3及pEGFP－β－连环蛋白质粒由美国匹兹堡大学医学院Dr.Wang Q.Jane惠赠，Rabbit Anti－PKD3Polyclonal Antibody（A300－319A）购自 Bethyl Laboratories，Mouse Anti－Beta－Catenin Monoclonal Antibody（SC－7963）购自Santa Cruz，逆转录和实时定量PCR试剂盒购自复能基因公司（FULGENE），实时定量PCR相关基因的引物由上海英俊公司设计和合成，其序列为 PKD3 正 向 引 物：5′－ACCCGTCCCACGATATGTCAGTA－3′，PKD3 反 向 引 物：5′－CAGCGTTTATGGCAGTTGAATTTG－3′；uPAR 正 向 引 物：5′－GGTGACGCCTTCAGCATGA－3′，uPAR 反 向 引 物：5′－CCCACTGCGGTACTGGACAT－3′；内参照基因为次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1（hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1，HPRT1），HRPRT1正向引物：5′－TGACACTGGCAAAACAATGCA－3′，HRPT1反向引物：5′－GGTCCTTTTCACCAGCAAGCT－3′。

1.2细胞株与细胞培养 人胚肾上皮细胞系HEK293细胞由本室保存，培养于DMEM完全培养基（10%胎牛血清、100 u/mL青霉素、100ng/mL链霉素）中，培养条件为37℃、5%CO2。

1.3质粒转染与实验分组

1.3.1实时定量PCR HEK293细胞按2.5×105/mL密度接种于6孔板中，24h后分别转入pEGFP－C2及pEGFPPKD3，24h后血清饥饿12h，继以100nM PMA刺激24h，上述4组分别记为CTL、CTL＋PMA、PKD3、PKD3＋PMA组。转染过程按照Hilymax说明书进行。

1.3.2免疫沉淀 将HEK293细胞接种于6cm培养皿中，24h后达到约50%融合密度，此时分别转染pEGFP－C2（CTL）或pEGFP－Beta－Catenin（Beta－Catenin），24h后血清饥饿16h，以DMSO或100nM PMA刺激1h后裂解上述4组细胞准备进行免疫沉淀分析。

1.4总RNA提取及逆转录 总RNA提取按照TRIZOL试剂盒说明书进行。逆转录按照复能基因（FULGENE）逆转录试剂盒说明书进行。

1.5实时定量PCR检测 按照复能基因（FULGENE）实时定量PCR试剂盒说明书进行，PCR反应：95℃预变性10min，95℃、10s，58 ℃、15s，72 ℃、20s，40个 循 环，72 ℃延伸10 min，72℃采集荧光信号。以Beta 2－微管蛋白（B2M）作为内参照基因，并采用相对定量法进行定量。相对表达量＝2－△△Ct［8］，△Ct＝目的基因平均Ct值－内参照基因平均Ct值，△△Ct＝实验组△Ct－对照组△Ct。

1.6免疫沉淀与免疫印迹

1.6.1免疫沉淀 向每个皿中加入预冷IP裂解缓冲液（40 mM Hepes，pH 7.5，120mM NaCl，1mM EDTA，10mM 焦磷酸钠，10mMβ－甘油磷酸钠，50mM 氟化钠，1.5mM 钒酸钠，0.3%CHAPS）500μL（约1×107个/mL）冰上裂解30min，期间摇动平皿几次以促使裂解液与细胞充分接触。裂解后的细胞经4℃、12 000×g离心10min，取上清液标为全细胞裂解液。蛋白定量后取500μg全细胞裂解液与相应的抗体4℃孵育过夜，孵育完成后加入蛋白A/G－琼脂糖树脂（根据抗体属性选择）4℃、2h，孵育完毕后用裂解缓冲液漂洗树脂3次，漂洗缓冲液（50mM Hepes，pH 7.5，150mM NaCl，1mM EDTA，0.3CHAPS）漂洗2次，每管加入40μL 2×SDS上样缓冲液100℃加热5min，12 000×g离心5min，取上清液进行SDSPAGE或者置－70℃保存。

1.6.2免疫印迹 收集细胞，加入细胞裂解液于冰上裂解30 min，于4℃、12 000×g离心20min，取上清液，用Bradford法测定蛋白浓度。取等量蛋白进行SDS－PAGE电泳并转位到PVDF膜上，最后采用化学发光法检测。具体步骤及试剂配方参见参考文献［9］。

2 结 果

2.1Western blot和实时定量PCR检测证实HEK293细胞中PKD3过表达 GFP－PKD3转染的HEK293细胞中PKD3明显过表达，而pEGFP－C2转染的HEK293细胞中未见外源性PKD3表达，而且有、无PMA刺激的GFP－PKD3转染的HEK293细胞PKD3表达一致（图1A、1B）。

图1 Western blot和实时定量PCR检测结果

2.2过表达PKD3增强HEK293细胞中PMA诱导的uPAR表达 在无PMA刺激时过表达PKD3即可明显上调HEK293细胞中uPAR转录水平，而PMA刺激则明显增强（图2）。

图2 在HEK293中过表达PKD3可增加PMA刺激诱导的UPAR转录

图3 HEK293细胞中PMA刺激诱导PKD3与β－连环蛋白相互作用。

2.3在HEK293细胞中PMA刺激诱导PKD3与β－连环蛋白结合 在HEK293中过表达PKD3可明显增强PMA刺激诱导uPAR转录（图2），而在结肠癌细胞和组织中过表达β－连环蛋白可明显上调uPAR mRNA和蛋白水平［7］，因此作者设想PKD3直接或间接通过β－连环蛋白上调uPAR转录活性。如图2所示，过表达β－连环蛋白的HEK293细胞在PMA刺激时PKD3与β－连环蛋白有明显的共沉淀现象，提示PMA可诱导PKD3与β－连环蛋白相互作用。有趣的是，即使在未转染GFP－β－连环蛋白CTL组中，免疫沉淀复合物中也检测到了约130×103的条带（NS），与GFP－β－连环蛋白相对分子质量极为接近。而在未做免疫沉淀的全细胞裂解液（Input）中，β－连环蛋白抗体同样检测到了此条带，提示该条带很可能代表一种可与PKD3及β－连环蛋白免疫复合物结合的非特异蛋白（图3）。

3 讨 论

作者前期研究证实，PKD3不仅调控前列腺癌细胞的增殖和存活［4］，还促进非小细胞癌A549的迁移和侵袭（尚未发表）。uPAR与uPA前体结合后可激活uPA的活性，激活纤维蛋白溶酶，降解细胞外基质，激活一系列基质金属蛋白酶，从而促进包括前列腺癌在内的多种肿瘤的迁移和侵袭［5－6］。本研究表明，单纯过表达PKD3即可上调HEK293中uPAR的转录水平，而以PMA激活PKD3活性后uPAR的转录水平更是明显上调，提示PKD3很可能通过上调uPAR的表达介导细胞的迁移和侵袭。

PKD3通过什么途径上调uPAR的表达呢？前期有研究提示，β－连环蛋白－TCF4信号通路可通过AP1间接上调结肠癌细胞和组织中uPAR的表达［7］，而近期有文献报道，PKD1可磷酸化β－连环蛋白并使之从细胞核转位到细胞膜并与ECadherin结合，从而促进肿瘤细胞的黏附，抑制其侵袭［10－11］。鉴于PKD1与PKD3的同源性和可能存在的功能拮抗，本研究假设PKD3可磷酸化β－连环蛋白并使之转位到细胞核，从而间接激活uPAR的转录。与之相符，PMA刺激HEK293细胞可诱导PKD3与β－连环蛋白直接结合，为进一步验证上述假设提供了有效证据。

在随后的研究中，作者拟采用激光共聚焦显微镜探求在不同细胞系（HEK293及前列腺癌细胞系）中及不同条件下PKD3与β－连环蛋白之间可能存在的共定位关系，并以亚细胞组分分离（subcellular fractionation）研究 PKD3及β－连环蛋白应对各种刺激时在细胞质、细胞膜和细胞核之间的穿梭情况 ，以进一步证实PKD3与β－连环蛋白之间的相互作用，并定位其相互作用的区域。同时作者还将在不同的前列腺癌细胞系中以报告基因Topflash验证PKD3的表达和活性是否调控TCF4的转录活性。

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