小鼠严重颅脑撞击伤早期咪唑安定－氯胺酮对肝脏GR与海马NR1变化的影响＊

屈 强，史 忠，粟永萍△

（1.泸州医学院附属医院麻醉科，四川646000；2.第三军医大学全军复合伤研究所，重庆400038）

近年来文献报道严重创伤后机体糖皮质激素受体（glucocorticoid receptors，GR）与创伤后应激反应紊乱的发生、继发性全身损害密切相关，而N－甲基－D－天门冬氨酸受体（N－Methyl－D－Asparate receptor，NR）在糖皮质激素抵抗（glucocorticoid resistant，GCR）的发生、发展中可能具有重要作用。有研究观察到使用NR拮抗剂氯胺酮等可明显抑制小鼠严重烧伤模型中GR的下调［1］，其机制不清。而NR拮抗剂和咪唑安定等苯二氮卓受体（GABA）激动剂已被大量研究证实具有脑保护作用。NR功能亚单位1（NR1）具有NR的电生理和药理学特性。因此如果能够从NR1入手，进一步研究GCR在应激中变化的中枢机制，并设法进行调控，将有可能为揭示严重创伤后应激反应紊乱以及防治严重继发性全身损害的发生提供重要的理论与实验依据。

1 材料与方法

1.1创伤模型制作及分组 取雄性KM小鼠150只（第三军医大学实验动物中心提供），体质量为22～26g，用BIM－Ⅲ型小型多功能动物撞击机制作清醒小鼠闭合性严重颅脑损伤（TBI）模型［2］。将其随机分为5组，每组30只。假致伤组（J组）不作撞击，仅固定与其他组相似时间；致伤对照组（N组）于致伤后10～15min腹腔注射0.9%生理盐水0.01mL/g；致伤后氯胺酮治疗组（K组）于致伤后10～15min腹腔注射氯胺酮（上海市第一制药厂生产）10mg/kg，即注射0.01%氯胺酮药液0.01mL/g；致伤后咪唑安定治疗组（M组）于致伤后10～15min腹腔注射咪唑安定（徐州恩华药业生产）0.3mg/kg，即注射0.003%咪唑安定药液0.01mL/g；致伤后复合用药治疗组（F组）于致伤后10～15min腹腔注射氯胺酮10mg/kg和咪唑安定0.3mg/kg，即注射0.003%咪唑安定及0.01%氯胺酮复合药液0.01mL/g。

1.2标本采集 各组均于致伤后30min及2、8、24、48、72h各断头处死5只小鼠，经颈动脉收集血液分离血清，用孔径0.22μm微孔滤器除菌后放置于－70℃冰箱保存。收集血液后，迅速取小鼠肝脏组织，冰上分离海马，均置于液氮保存。小鼠肝脏、海马组织各100mg分别加入1mL RIPA组织细胞裂解液（上海申能博彩生物有限公司生产），按说明书操作，提取肝脏总蛋白，采用Bradford法测定蛋白浓度，置于－70℃冰箱备用。

1.3血清 TNF－α、IL－1β的测定 TNF－α、IL－1β均采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测试剂盒（晶美生物工程有限公司生产），操作步骤按照试剂盒说明书进行。

1.4GR/NR1Western blot分析 每个样本取40μg蛋白，加入等体积2×SDS－PAGE上样缓冲液，混合，99℃变性5min后冰浴，微量加样器上样。经6%聚丙烯酰胺100v恒压电泳后，80mA电转印至PVDF膜（过夜），5%牛奶蛋白37℃封闭3h，加入1∶400稀释GR/NR1一抗（兔抗小鼠GR/NR1，Santa cruz美国）37℃孵育3h，PBST洗膜后加入单过氧化酶标记二抗（山羊抗兔IgG，博士德）37℃孵育3h，PBST洗膜后加入DAB显色，采用Geldoc2000凝胶成像系统（Bio－Rad公司 美国）成像和分析处理，蛋白含量以ODu×面积表示。

1.5统计学方法 所有数据均以s表示，用SPSS10.0统计软件处理，组间比较采用配对样本t检验，组内采用单因素方差分析，以P＜0.01为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组血清中TNF－α含量测定结果 各组TNF－α含量于致伤后30min均明显增高（P＜0.01），8h达高峰（P＜0.01）；J组明显低于其他各组（P＜0.01）；N组明显高于其他各组（P＜0.01），但24h后各组间差异逐渐缩小；F组在伤后8h明显低于其他各组（P＜0.01），48h明显低于 K组（P＜0.01），见表1。

2.2各组血清中IL－1β含量测定结果 各组IL－1β含量于致伤后30min均明显增高（P＜0.01），24h达高峰（P＜0.01）；J组明显低于其他各组（P＜0.01）；2h后N组明显高于其他组（P＜0.01）；F组在伤后8h明显低于其他各组（P＜0.01）；但24h后各组间差异逐渐缩小，见表2。

表1 各组血清中TNF－α含量测定结果（ng/mL，s，n＝5）

表1 各组血清中TNF－α含量测定结果（ng/mL，s，n＝5）

＊：与J组比较，P＜0.01；＃：与N组比较，P＜0.05；＆：与F组比较，P＜0.01。－：表示无数据。

30min 2h 8h 24h 48h J组组别0.14±0.058 0.01±0.008 － － －N 组 17.14±2.329＊ 13.48±1.177＊ 32.98±3.155 23.03±1.254 14.14±4.460 F组 15.06±0.470＊＃ 10.55±0.890＊＃ 25.24±1.632＃ 21.87±1.717 12.6±1.036＃K 组 16.86±1.952＊ 11.65±0.986＊＃ 28.09±2.662＃＆ 22.82±1.359 14.78±4.600 ＆M 组 17.26±1.743＊ 11.99±1.291＊＃ 30.57±2.725＃＆22.49±1.490 13.92±2.498

表2 各组血清中IL－1β含量测定结果（ng/mL，s，n＝5）

表2 各组血清中IL－1β含量测定结果（ng/mL，s，n＝5）

＊：与J组比较，P＜0.01；＃：与N组比较，P＜0.05；＆：与F组比较，P＜0.01。－：表示无数据。

30min 2h 8h 24h 48h J组组别0.012±0.0019 0.007±0.0026 0.003±0.0014 － －N 组 0.131±0.0063＊ 0.111±0.0064＊ 0.085±0.0151＊ 0.204±0.0177 0.138±0.0201 F组 0.130±0.0058＊ 0.081±0.0054＊＃ 0.070±0.0091＊＃ 0.176±0.0151＃ 0.120±0.0070＃K组 0.132±0.0057＊ 0.093±0.0063＊＃ 0.082±0.0120＊＆ 0.180±0.0109＃ 0.128±0.0161 M 组 0.130±0.0058＊ 0.099±0.0123＊＃ 0.077±0.0060＊＆ 0.201±0.0138 ＆0.130±0.048

表3 致伤后各组肝脏GR蛋白表达结果（s，n＝5）

表3 致伤后各组肝脏GR蛋白表达结果（s，n＝5）

＊：与N组比较，P＜0.01；＃：与F组比较，P＜0.01；＆：与 M组比较，P＜0.01。

致伤后IOD与J组IOD的比值组别30min 2h 8h 24h 48h 72h N 组 0.737±0.098 0.414±0.217 0.452±0.214 0.468±0.263 0.566±0.046 0.509±0.103＆F组 0.842±0.096＊ 0.545±0.143＊ 0.681±0.118＊ 0.657±0.198＊ 0.673±0.242＊ 0.581±0.188＊＆K组 0.782±0.153＊ 0.503±0.158＊ 0.564±0.140＊＃ 0.594±0.243＊ 0.554±0.166 0.579±0.183＊＆M 组 0.764±0.164＃ 0.515±0.221＊ 0.583±0.207＊＃ 0.479±0.125＃ 0.512±0.212＃ 0.425±0.222＊

表4 N组和F组海马NR1蛋白表达结果（s，n＝5）

表4 N组和F组海马NR1蛋白表达结果（s，n＝5）

＊：与N组比较，P＜0.01。

致伤后IOD与J组IOD的比值组别0.135 1.055±0.204 1.137±0.154 F组 0.975±0.032 0.886±0.231＊ 0.882±0.129 1.015±0.141＊ 1.047±0.100 0.990±0.189 30min 2h 8h 24h 48h 72h N 组 0.964±0.104 0.807±0.127 0.858±0.171 0.922±＊

2.3致伤后各组肝脏GR蛋白表达 致伤后各组肝脏GR蛋白表达在致伤后30min开始均明显降低（P＜0.01），2h达到最低（P＜0.01）；N组明显低于其他各组（P＜0.01）；8h后F组明显高于其他各组（P＜0.01）；M组在伤后72h明显低于其他各组（P＜0.01）；但24h后各组间差异逐渐缩小。蛋白含量均以致伤后IOD与J组IOD的比值表示，见表3、图1。

2.4N组和F组海马NR1蛋白表达 海马NR1蛋白表达在致伤后2h开始均明显降低（P＜0.01），至24h基本恢复，72h明显增加（P＜0.01）；2、24hF组明显高于N组（P＜0.01）；但伤后72hF组明显低于N组（P＜0.01）。蛋白含量均以IOD与J组IOD的比值表示，见表4、图2。

图1 致伤后各组肝脏GR蛋白在不同时间点变化的Western blot检测结果

图2 N组和F组NR1蛋白在不同时间点变化的Western blot检测结果

3 讨 论

应激产生的一系列非特异性神经内分泌反应目的是使机体抵抗力增强，保持和恢复内稳态。病理应激危害的主要原因之一是由高浓度糖皮质激素（GC）造成的。应激反应程度一般与应激原刺激强度呈正相关，刺激越强，反应越强。当刺激原过度强烈，如严重创伤时，由于生物机体的高度复杂性，机体往往不能做出适度反应，而出现应激紊乱，甚至危及生命。GC效应是机体最为重要的应激反应之一，其中GR是GC效应发挥的关键环节［3］。本研究结果表明，严重TBI引起机体中枢和外周GR蛋白表达下调，从而有可能促进过度炎症反应形成和引发全身炎症反应综合征（SIRS）、多器官功能障碍综合征（MODS）等全身继发性损害，甚至死亡。因此通过采取适当措施，调控创伤后GR的反应具有重要意义。

目前关于麻醉药物、麻醉方法对细胞因子的影响尚有争议。以往认为，在单核细胞培养系统中静脉麻醉剂（相当于临床剂量）诱导细胞因子产生，氯胺酮以剂量依赖性方式抑制内毒素刺激TNF－α的分泌，而在没有内毒素的情况下，氯胺酮并无作用。但近年研究揭示，氯胺酮具有直接抑制内毒素诱导的IL－6、8分泌的作用［4－5］。本实验结果显示，各致伤组 TNF－α和IL－1β含量伤后30min均明显增高，24h后各组间差异逐渐缩小。F组明显低于N组，而复合应用两种药物比单独应用时降低更为明显。这也证实了相关研究结果，氯胺酮等可以明显抑制炎性因子的释放。而IL－1β、TNF－α与脑创伤密切相关，因此氯胺酮－咪唑安定在TBI模型中能明显降低这两种细胞因子对脑保护和应激调控就具有了更为重要的意义。并且复合应用氯胺酮－咪唑安定后在伤后48h仍然与N组有明显差异，这已经超过了药物的代谢周期，说明其机制可能存在中枢和外周等多种途径，尚需进一步的研究说明。

本实验结果显示，小鼠严重TBI后存在GCR，肝脏GR蛋白表达明显降低［6］，氯胺酮－咪唑安定虽然没有改变肝脏GR蛋白表达变化趋势，但明显改善了GR蛋白表达的降低。各致伤组肝脏GR蛋白表达均明显降低，N组明显低于其他各组，F组明显高于K、M组，各组间差异随时间逐渐缩小。咪唑安定和氯胺酮复合应用抑制TBI后GR蛋白表达下调的机制尚不清楚，可能是抑制了伤后下丘脑－垂体－肾上腺（HPA）轴过度兴奋或（和）通过NR、GABA等抑制海马GR蛋白表达下调，还可能与神经中枢有效的镇静、镇痛，作用于交感－肾上腺髓质和HPA轴，减轻创伤后组织损伤、疼痛、失血、缺氧、恐惧等引起的过度应激反应，从而抑制炎性细胞因子的生成和释放等有重要关系。有文献报道，GC在海马介导应激性刺激的适应性反应，在应激后1h海马GR mRNA明显下降，这可能被NR、GABA等介导［7］。氯胺酮和咪唑安定作为通过NR和GABA作用药物，在亚麻醉剂量出现明显应激调控作用，其作用机制之一是否是通过NR和GABA影响HPA轴兴奋性，还有许多问题尚待阐明。而作者的前期研究也观察到腹腔注射咪唑安定－氯胺酮后可明显降低小鼠死亡率［2］，因此对严重创伤（如TBI、烧伤、战伤等）后应激反应早期合理地使用咪唑安定－氯胺酮可能有助于减轻机体应激反应，利于创伤后恢复，提高生存率。

海马结构广泛参与了学习、记忆等许多重要的生理过程，具有全脑缺血变化的全部特点。因此海马是研究TBI等脑损伤与NR亚单位及其mRNA关系的理想对象。激活NR将导致HAP轴兴奋性增加［7－8］；NR激动剂可以升高血皮质醇水平，而NR拮抗剂AP－5可抑制谷氨酸引起的促肾上腺皮质激素释放因子释放，其原因可能是通过NR介导影响促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）、肾上腺皮质激素释放激素（ACTH）释放，最终影响GC水平。此外NR还可能通过某种途径影响海马GR蛋白表达量，而影响HPA轴负反馈［7］；MR对于皮质激素的亲和力比GR高得多，静息时其结合已基本饱和，参与基础水平HPA轴的负反馈调节；应激时高水平皮质激素不仅与MR结合，也与GR结合通过一定途径抑制HPA轴过度反应。本实验发现，小鼠海马NR1蛋白表达于致伤后2h开始明显降低，至24h基本恢复，72h明显增加。而F组2、24h明显高于N组，但伤后72hF组明显低于N组。这是一个有趣的现象，当NR1蛋白表达降低时，应用咪唑安定－氯胺酮可以减轻这种变化；当NR1蛋白表达增高时，却又可以抑制这种增高，即趋向于维持一种稳态。而单独应用咪唑安定－氯胺酮却无此现象，这似乎提示咪唑安定－氯胺酮在小鼠严重TBI中调控应激、影响GR表达，其作用机制除了通过NR、GABA等环路作用影响HPA轴兴奋性、通过外周直接作用影响细胞因子释放外，是否还具有其他机制直接影响或维持海马NR稳态，从而控制HPA轴状态，尚有待进一步探讨。

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