高糖对血管内皮细胞增殖及HGFmRNA表达作用的影响

范莲芝,孙喜明,王桂英,孟德雁

糖尿病以慢性高血糖为主要共同特征。高血糖致血管内皮细胞受损是形成动脉粥样硬化的重要原因之一。肝细胞生长因子(HGF)是由间质来源细胞分泌的多效性生长因子,具有促进多种类型的细胞增殖、迁移和新生血管形成的作用[1]。本文研究了不同作用时间高糖对人血管内皮细胞(EC304)增殖及HGFmRNA表达的影响,探讨糖尿病患者高血糖致血管内皮细胞受损的原因。

1 资料与方法

1.1 主要试剂与仪器 RPMI1640(Gibco),胎牛血清(杭州四季青),Trizol(上海生工),RT-PCR试剂盒(大连宝生物),PCR仪(PTC100型),电泳仪(型号PS3000),紫外凝胶图像分析系统(UVP型号GDS7500),其余为国产分析纯。

1.2 细胞培养 人血管内皮细胞(EC304,南京凯基生物工程有限公司提供)。EC304细胞培养于含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基中,置37℃含5%二氧化碳培养箱中孵育,待长致瓶底的60%～80%,用0.05%的胰蛋白酶消化、传代。

1.3 M TT法分析高糖对血管内皮细胞增殖的作用 将对数生长期细胞以5×104/mL密度接种于96孔培养板中。孵育24 h后,改用无血清培养液孵育24 h,使细胞处于相对静止期后按下列方法分为4组。对照组,培养液含D-葡萄糖浓度为5.5 mmol/L。15 mmol/L组,培养液 D-葡萄糖浓度为15 mmol/L。25mmol/L组:培养液D-葡萄糖浓度为25mmol/L。35mmol/L组,培养液D-葡萄糖浓度为35mmol/L。每组设6个复孔,同时设调零孔。分别于培养后6 h、12 h、24 h、48 h、96 h进行M TT检测。为排除培养液中营养成分消耗对结果产生的影响,每隔48 h换 1次培养上清。反应结束后每孔加入 25 μL M TT(5 mg/mL)溶液,继续孵育4 h,弃上清,每孔加入100 μ L二甲基亚砜(DMSO),在微型混合器上振荡30 min后于酶标仪490 nm处测光吸收(OD)值。

1.4 RT-PCR方法检测HGFmRNA的表达

1.4.1 总RNA的提取 将对数生长期的血管内皮细胞以2×105/mL的密度转种于50 cm2的细胞培养瓶中,同步化后分为两组,对照组培养液含D-葡萄糖浓度为5.5 mmol/L。高糖组培养液含D-葡萄糖浓度为25 mmol/L。每组同时重复3次。于培养6 h、12 h、24 h、48 h、96 h 后用 Trizol试剂提取细胞总RNA,提取的细胞总RNA用紫外分光光度计测定RNA的纯度;OD260与OD280比值为1.8～2.0,说明 RNA纯度符合实验要求。

1.4.2 RT-PCR HGF根据Genebank的大鼠HGF基因cDNA序列由Primer3软件设计:上游引物:5'-ACA GCT TTT TGC CTT CGAGCT A-3';下游引物:5'-CAT CAA AGC CCT TGT CGG GAT A-3'。预期扩增产物长度290bp。内参照为GAPDH,引物设计参照文献[2]:正义序列:5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3',反义序列:5'-TCCACCA CCCTGTTGCTGTA-3';PCR反应参数为:预变性94℃5 min,变性94℃30 s,退火 58 ℃30 s,延伸72 ℃45 s,共 30个循环,再延伸72℃5 min;预期扩增产物大小为450bp。

1.4.3 PCR产物的检测 用0.5×TEB制备1.8%琼脂糖凝胶,在0.5×TEB中恒压电泳,完毕后经紫外凝胶图像分析仪进行数据分析,以目的基因mRNA扩增后产物的紫外OD值与内参照GAPDHmRNA扩增后产物紫外OD值的比值作为HGFmRNA的相对值。

2 结 果

2.1 各组不同作用时间的细胞增殖 对照组(5.5 mmol/L组)细胞从6 h～96 h持续增殖。EC304在高糖的诱导作用下,6 h时各组细胞增殖能力无明显差别,但随着作用时间的延长,作用12 h时,细胞增殖较对照组明显增强,且随着浓度的增加,细胞增殖明显增强,细胞增殖致24 h达高峰,48 h细胞增殖被抑制,细胞数量较24 h明显减少,出现抑制细胞增殖的现象,96 h细胞的数量进一步减少,且呈浓度依赖性。详见表1。

表1 高糖对EC304细胞增殖的影响(±s)

表1 高糖对EC304细胞增殖的影响(±s)

组别 6 h 12 h 24 h 48 h 96 h 5.5 mmol/L组 0.221±0.012 0.290±0.008 0.401±0.011 0.625±0.005 0.990±0.025 15 mmol/L组 0.227±0.010 0.357±0.0081) 0.474±0.0051) 0.428±0.0071) 0.376±0.0111)25 mmol/L组 0.223±0.010 0.419±0.0071) 0.536±0.0061) 0.435±0.0061) 0.309±0.0101)35 mmol/L组 0.222±0.009 0.470±0.0101) 0.664±0.0121) 0.448±0.0071) 0.222±0.0111)与对照组(5.5 mmol/L)相比,1)P＜0.05

2.2 各组细胞HGFmRNA的表达 作用6 h,高糖组HGFm RNA的表达与对照组无明显差别,作用12 h,高糖组HGFmRNA的表达较对照组升高,作用24 h,HGFmRNA的表达开始降低,随着作用时间的延长,HGFmRNA的表达逐渐降低,即高糖降低HGF mRNA的表达。详见表2。

表2 高糖对EC304 HGFmRNA表达的影响(±s)

表2 高糖对EC304 HGFmRNA表达的影响(±s)

组别 6 h 12 h 24 h 48 h 96 h对照组 0.839±0.047 0.840±0.033 0.827±0.052 0.867±0.033 0.859±0.032高糖组 0.816±0.069 1.451±0.1261) 0.756±0.620 0.611±0.0191) 0.422±0.0121)与对照组相比,1)P＜0.05

3 讨 论

糖尿病以慢性高血糖为共同特征。血管内皮细胞分泌多种血管活性物质,血管内皮细胞功能紊乱促进动脉粥样硬化;高血糖造成内皮细胞功能失常,使多种内皮细胞源性因子如HGF、前列腺环素(PGI2)、一氧化氮(NO)、C型利钠素(CNP)等合成减少,导致血管的硬化改变[3],因而保护血管内皮细胞可抑制动脉粥样硬化,减少糖尿病人群心脑血管病患病率。

血管内皮损伤是血管病变的基础,糖尿病有多种因素可直接或间接导致血管壁受损,使内皮细胞功能紊乱,内皮损伤可能是动脉粥样硬化起始过程,随后出现血小板生长因子释放,后者引起血管平滑肌增生[4]。本实验观察到高糖早期通过上调HGFmRNA的表达诱导细胞增殖,晚期HGFmRNA表达下调,诱导细胞凋亡。高糖刺激血管内皮细胞早期增殖可能的机制之一是:血管内皮细胞作为对高糖损伤应激性地引起HGF分泌增加,即高糖环境下12 h,HGFmRNA表达上调,细胞增殖明显增加,随着作用时间的延长,高糖诱导细胞凋亡,HGFmRNA表达下调。高糖环境下bax-caspase蛋白激酶被激活而诱导细胞凋亡,且浓度增加细胞死亡明显增加,高葡萄糖主要增加bax蛋白,而不影响bcl-2,并且激活 caspase3和caspase9;而 HGF主要增加bcl-2的表达,影响 bax水平,并且减少 caspase3和caspase9的活性;高D-葡萄糖引起bax蛋白的迁移也能够被过度表达bcl-2完全阻断[5]。另外高浓度D-葡萄糖通过促进转化生长因子β(TGF-β)分泌抑制局部 HGF产生,而 HGF具有明显的促细胞有丝分裂增殖作用,给予TGF-β抗体可以抑制这种减少[6]。因而HGF系统在糖尿病动脉粥样硬化中具有重要作用。

临床可应用HGF抑制或延缓动脉粥样及促进新生血管形成。Morishita等[7]对患有严重肢体缺血性疾病患者给予HGF质粒DNA治疗,认为肌注HGF质粒DNA治疗是安全有效,并且能够获得成功治疗。

HGF系统在糖尿病动脉粥样硬化中具有重要作用,HGF可促进血管内皮细胞增殖、迁移和新生血管形成,抑制其凋亡,在内皮细胞的凋亡与增殖平衡中发挥重要作用,维持血管内皮细胞功能;抑制动脉粥样硬化,减少糖尿病患者心脑血管的并发症。

[1] Mo rishita R,Aoki M,Hashiya N,et al.Therapeutic angiogenesis using hepatocyte g rowth factor(HGF)[J].J Curr Gene Ther,2004,4(2):199-206.

[2] Yoshida S,Harada T,Mitsunari M,et al.Hepatocyte g rowth factor/met system promotes endometrial and endometriotic stromal cell invasion via autocrine and paracrine pathways[J].Clin Endocrinol Metab,2004,89(2):823-832.

[3] Nishimura M,Ushiyama M,Ohtsuka K,et al.Serum hepatocyte g rowth factor as a possible indicator of vascular lesions[J].J Clin Endocrinol Metab,1999,84(7):2475-2480.

[4] T schoepe D,Roesen P,Schwippert B,et al.Platelets in diabetes:T he role in the hemostatic regulation in atherosclerosis[J].Semin T hromb Hemost,1993,19(2):122-128.

[5] Nakagami H,Morishita R,Yamamoto K,et al.Hepatocyte g rowth factor prevents endothelial cell death through inhibition of bax translocation from cytosol to mitochondrial membrane[J].Diabetes,2002,51(8):2604-2611.

[6] Morishita R,Nakamura S,Nakamura Y,et al.Potential role of an endothelium-specific g rowth factor,hepatocyte g rowth factor,on endothelial damage in diabetes mellitus[J].Diabetes,1997,46(1):138-142.

[7] Mo rishita R,Aoki M,Hashiya N,et al.Safety evaluation of clinical gene therapy using hepatocyte growth factor to treat peripheral arterial disease[J].Circulation,2004,44(2):203-209.