补阳还五汤合六味地黄汤对局灶性脑缺血大鼠脑组织bFGF表达的影响1)

李国菁,严浩成,王行宽,孙桂香

碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是一种具有多种生物学活性的多肽生长因子。它不仅能保护神经元,促进神经生长,还能减小脑缺血后梗死体积、恢复神经功能等作用,被认为将是最具有临床应用价值的神经营养因子[1]。

益气活血之补阳还五汤是治疗缺血性中风公认的有效方剂,临床和动物研究证实对脑组织细胞的形态和功能具有多方面的作用[2-4],为缺血性中风各期通用之方,但该方仅针对脑络瘀阻而言,并无补肾益精生髓,充养髓海,濡润脑络之功,故研究者于临证之时,常用六味地黄汤合补阳还五汤治之,共奏补肾益精以健脑,益气活血以通络之功,可明显提高疗效。本研究将两方合用,观察其对缺血不同时段bFGF的影响,探讨合方抗脑缺血损伤的机制及两方之间是否存在协同作用。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 健康SD老龄大鼠,(20～22)月龄,雄性,体重400 g～550 g,普通级,由湖南农业大学动物实验室提供。老龄SD大鼠先按体重大小分层,再采用随机数字表法随机分为5组,即健脑通络汤组(A+B组)、六味地黄汤组(A组)、补阳还五汤组(B组)、模型组、假手术组。

1.2 药物与试剂 健脑通络汤、六味地黄汤、补阳还五汤(由湖南中医药大学附一院制剂室提供,生药含量分别为2.42 g/mL、0.83 g/mL、1.58 g/mL)。bFGF免疫组化试剂盒,由武汉博士德生物工程有限公司提供。

1.3 主要仪器 分析天平(AB204-S,台湾),电子天平(YY3002,上海精宏科学仪器有限公司),超低温冰箱(38257 HO/REV-B,美国),高速冷冻离心机(TGL16G-SM 型,德国),电热恒温培养箱(DNP-9162型,上海精宏实验设备有限公司),石蜡切片机(FINESSE 325,Thermo Shandon),Leica Microsystems(LEICA DM LBZ,德国),METT LER(L006 OSI,TOLEDO),BIOMEDICAL FREEZER(MCF-V5411,SANYO Electric Biomedical Co.Ltd),Motic摄像系统(B5 professional series,台湾),MIAS医学图像分析管理系统(北航)。

1.4 模型制作方法 按照改良Haruo Nagasawa方法[5]建立大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)持续脑缺血模型。造模成功大鼠分别于缺血后24 h、72 h、7 d断头处死。该模型成功的标志为大鼠苏醒后出现同侧Horner征和对侧以前肢为重的偏瘫。

1.5 神经功能缺损评分 参照《现代药理实验方法学》[6],分别于术后24 h、72 h、7 d进行评分。根据标准评分,满分为11分。分数越高,动物行为障碍越严重。评分＞5分,则表明模型成功,低于5分则予以剔除。

1.6 给药方式及途径 药物剂量换算参照剂量体表面积换算法[7],各组动物均在麻醉0.5 h之前半量给药1次,麻醉清醒6 h后再给另一半,以后每天分别于08:00～09:00,16:00～17:00两次灌胃。

1.7 取材及测定 各组大鼠分别在缺血24 h、72 h、7 d取材。实验动物经麻醉成功后,打开胸腔,用生理盐水200 mL经左心室快速冲洗,继用4%多聚甲醛400 mL灌流固定。取脑后置入4%多聚甲醛内固定6 h。常规脱水,石蜡包埋,进行冠状切片,每隔200 μ m连续取2张,保存备用。bFGF免疫组化严格按照试剂盒提供的方法进行。

1.8 图像及统计分析 采用MIAS医学图像分析管理系统软件包进行图像分析,每张切片在10目镜×40物镜的显微镜下,分别在缺血灶、缺血边缘区、海马、大脑皮层及皮层下随机选取5个视野,计算每个视野中阳性细胞数。应用SPSS 11.5软件进行方差分析,结果以均数±标准差(±s)表示。

2 结 果

2.1 模型bFGF阳性细胞总数的判定 假手术组中仅发现少量的bFGF免疫阳性细胞表达,呈棕黄色,以胶质细胞为主,神经细胞也有少量表达。模型组在缺血后24 h后,bFGF免疫阳性细胞表达明显增多,主要分布在缺血周围区的神经元和神经胶质细胞中。bFGF阳性细胞表达24 h时达高峰,72 h时开始下降,7 d时只有少量表达。模型组bFGF免疫表达的阳性细胞数与假手术组比较,24 h、72 h均有明显增加(P＜0.01),但在缺血后7 d时无统计学意义(P＞0.05)。详见表1。

表1 模型组与假手术组bFGF细胞总数比较(±s)

表1 模型组与假手术组bFGF细胞总数比较(±s)

组别 n 24 h 72 h 7 d模型组 8 101.88±21.21 75.13±22.3139.75±12.29假手术组 8 45.26±7.17 36.42±5.25 35.08±5.06 t值 7.152 4.772 0.963 P ＜0.01 ＜0.01 ＞0.05

2.2 神经功能评分比较 缺血后24 h、72 h、7 d的神经功能评分,各法与不使用该法进行比较,有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01);各法及模型组之间进行2×2的析因分析,A法为六味地黄丸,B组为补阳还五汤组,A+B组为六味地黄丸合补阳还五汤组。A、B两法存在交互作用,比单独用A法或B法效应强。从神经功能评分的4个均值来看,模型组＞A＞B＞A+B,显示出不用A、B两法的模型组神经功能评分最高,经A法干预的评分稍低,经B法干预的神经功能评分比 A法低,经 A、B两法同时干预的神经功能评分最低。六味地黄汤和补阳还五汤合用能协同降低急性持续脑缺血大鼠的神经功能评分,其作用优于单用,即健脑通络汤优于六味地黄汤及补阳还五汤;其中单用补阳还五汤优于单用六味地黄汤。详见表2。

表2 各治法对神经功能评分的方差分析(±s)

表2 各治法对神经功能评分的方差分析(±s)

组别 n 24 h评分(±s F值 P 72 h评分7 d评分F值 P(±s F值(±s P A组 16 9.00±0.54 7.177 ＜0.05 4.00±0.76 15.831 ＜0.01 1.25±0.46 14.000 ＜0.01 B组 16 8.75±0.46 14.975 ＜0.01 3.75±0.89 22.436 ＜0.01 0.88±0.84 28.571 ＜0.01 A+B组 8 7.75±0.46 4.342 ＜0.05 3.13±1.13 4.344 ＜0.05 0.50±0.54 4.571 ＜0.05模型组 8 9.13±0.84 6.00±0.90 2.63±0.74

2.3 脑组织缺血区bFGF免疫组化分析 缺血后24 h、72 h、7 d的bFGF阳性细胞总数表达,各法与不使用该法进行比较,有统计学意义(P＜0.01);各法及模型组之间进行2×2的析因分析,表明A、B两法存在交互作用,比单独用A法或B法细胞总数表达多。且从表中表达的阳性细胞总数的4个均值来看,模型组＜A＜B＜A+B,显示出不用 A、B两法的模型组阳性细胞总数表达得最少;经A法干预的阳性细胞总数表达得稍高;经B法干预后所表达的阳性细胞总数比A法的高,经A、B两法同时干预后所表达的阳性细胞总数最高。六味地黄汤和补阳还五汤合用能协同提高急性持续脑缺血大鼠的bFGF阳性细胞总数,使其表达增强,其作用优于单用,即健脑通络汤优于六味地黄汤及补阳还五汤;其中单用补阳还五汤优于单用六味地黄汤。详见表3。

表3 各治法对bFGF阳性细胞总数表达影响的方差分析(±s)

表3 各治法对bFGF阳性细胞总数表达影响的方差分析(±s)

组别 n 24 h评分(±s F值 P 72 h评分7 d评分(±s F值 P(±s F值P A组 16 165.25±27.61 18.708 ＜0.01 121.63±20.97 11.123 ＜0.01 68.25±15.53 8.653 ＜0.01 B组 16 185.50±24.32 44.897 ＜0.01 148.88±24.55 47.476 ＜0.01 102.38±11.28 87.727 ＜0.01 A+B组 8 195.88±22.86 9.662 ＜0.01 153.50±18.44 7.462 ＜0.05 105.13±19.59 5.875 ＜0.05模型组 8 101.88±21.21 75.13±22.31 39.75±12.29

3 讨 论

近年来发现,脑缺血引起一系列损伤级联反应导致细胞死亡的同时,亦触发机体多种保护因子的表达,在不同环节拮抗损伤作用,修复受损神经元。神经营养因子虽然能够从提高自由基清除剂的活力、拮抗EAA的神经毒性、稳定细胞内Ca2+浓度、抑制凋亡因子表达、增强蛋白激酶C(PKC)的活性等多途径对抗脑缺血损伤并促进损伤后神经元的修复,但由于神经营养因子多为大分子肽,难以通过血脑屏障,因此外周给药难以到达作用部位,而脑内给药又会加重缺血损伤,而且操作非常复杂。所以,充分诱导内源性神经营养因子及其受体的表达,可能是进行脑保护的重要途径。大量的动物实验证实补肾益气活血中药能从多方面改善缺血性中风的病理状态,多环节进行脑细胞的保护,促进神经功能的恢复。

健脑通络汤根据缺血性中风以肾精气亏虚为本,脑络瘀阻为标之说[8-10],撷取六味地黄丸合补阳还五汤,命名为“健脑通络汤”,方中以熟地黄、黄芪为君,前者滋阴补肾、填精益髓以健脑,后者大补气阳,令气旺血行,冀瘀去络通以治缺血之本。山萸肉补养肝肾,山药补益脾之气阴,川芎行气活血,归尾长于活血,且有化瘀而不伤血之妙,四者共为臣药,除加强君药的补肾作用外,尚有兼顾肝脾、行气活血,使肾之精气易于上行输注于脑。赤芍、桃仁、红花助归尾活血祛瘀,茯苓淡渗脾湿,泽泻利湿泄浊,并防熟地之滋腻,丹皮清泄相火,并制山萸肉之温涩,以上共为佐药。地龙清热熄风,通络利尿,用之一则引药入病变之经络;一则兼以清热熄风;一则使脑中留饮下行从小便而去,寓“病在上而取之下”之意,列为使药。该方通补并施,温清兼顾,补而不恋邪,通而不伤正,通过补肾以健脑;化瘀以通络,共奏补肾健脑化瘀通络之功。

bFGF是神经营养因子的一种,具有多种生物活性,可促进体外培养的神经元存活及突起生长,拮抗兴奋性氨基酸毒性,对抗细胞内钙超载,拮抗自由基,从而减轻以上各因素引起的神经元损伤。bFGF对神经元、胶质细胞、血管内皮细胞等多种组织均有营养作用,因此被认为是最具有临床应用价值的神经营养因子,而且已肯定其对神经保护的作用[11]。

在正常情况下,脑内仅有少量bFGF表达,但在短暂脑缺血后其可能作为一种自我保护反应而表达明显增多。本实验研究发现,假手术组中神经元及神经胶质细胞均有少量的bFGF阳性细胞表达,以神经胶质细胞表达为主。模型组在缺血24 h后,bFGF免疫阳性细胞表达明显增多,主要为缺血区周围存活的神经元和神经胶质细胞;缺血72 h后,bFGF免疫阳性细胞表达开始下降;缺血7 d后,bFGF只有少量表达。模型组bFGF免疫表达的阳性细胞数与假手术组比较,缺血后24 h,72 h均有明显增加(P＜0.05或P＜0.01),但在缺血后7 d时没有明显差异。这说明缺血性脑损伤能诱导内源性bFGF的表达,且其表达呈一定的时间规律性。本研究还发现,应用药物后,内源性bFGF显著上调,神经功能评分相应减轻,提示中药能通过启动内源性神经营养因子的表达进而加强脑缺血后的修复过程,这可能是其神经保护作用的机制之一。补肾益气活血的健脑通络汤这一作用最为明显,补阳还五汤次之,六味地黄汤又次之,两者之间存在协同作用。

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[11] Bethel A,Kirsh JR,Koehler RC,et al.Intravenous basic growth factor decreases brain injury resulting from focal ischemia in cats[J].Stroke,1997,28:609-616.