芪红合剂含药血清对人外周血内皮祖细胞数量及其功能的影响

马 华,武丽萍

血管内皮祖细胞(EPCs)是成年个体中与血管新生关系最为紧密的干细胞成分。

本研究拟采用血清药理学、体外细胞培养、细胞荧光免疫等方法观察中药复方芪红合剂对体外培养的EPCs数量及黏附功能的影响。旨在探讨益气活血化瘀中药复方芪红合剂可能的内皮保护作用机制,同时为血管内皮损伤及功能障碍相关性疾病的防治提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 雄性 Wistar大鼠 12只,体重(200±11)g,山西医科大学实验动物中心提供;中药芪红合剂由黄芪、红花、大黄等组成,上药按比例称取后,煎制浓缩为含生药1.4 g/mL的合剂,山西医科大学第二医院中药制剂室制备;FITC标记荆豆凝集素Ⅰ(FITC-UEA-I)、人纤维连接蛋白(HFN),Sigma公司;Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-acLDL),Molecular Probe公司;CD133,Ancell公司;CD34,BD公司,血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF),Peprotech公司;淋巴细胞分离液,上海华精生物高科技有限公司;M199培养基,Gibco公司;胎牛血清,杭州四季青生物工程材料研究所。

1.2 方法

1.2.1 制备含药血清 取大鼠,随机分成4组:中药芪红合剂组(低剂量组、中剂量组、高剂量组)、对照组。分别给予7.5 g/kg、15 g/kg、30 g/kg的芪红合剂水煎剂及等容积的生理盐水灌胃,每日2次,连续7d。最后1次灌药前禁食不禁水12h,灌药后2 h,心脏采血,室温静置2 h～4 h,待血凝固后,4℃冰箱过夜,3 000/min离心 10 min,提取血清,同组血清混匀,经56℃、30 min灭活处理后,0.22 μ m滤膜过滤除菌,-70℃保存备用。

1.2.2 EPCs的分离、培养 采取10名健康成人志愿者空腹外周血(志愿者排除吸烟、近期外伤、手术史、皮肤溃疡、糖尿病、心血管疾病等影响EPCs的因素),40 mL肝素抗凝。以2 000/min、1500/min离心5min～10min,重悬细胞于M 199培养基(含 20%胎牛血清,VEGF 10 μ g/L,FGF 2 μ g/L,青霉素 100 kU/L,链霉素100 kU/L)中,并接种至培养瓶中培养。置37℃5%CO2孵箱培养5 d后,PBS洗掉非贴壁细胞,换培养液继续培养至7 d,PBS洗掉非贴壁细胞,收集贴壁细胞。相差倒置显微镜下观察贴壁细胞生长情况。

1.2.3 EPCs的鉴定 ①细胞表型鉴定消化收集培养7 d的贴壁细胞,调节细胞浓度为1×106/mL。PBS洗涤2次,重悬于500 μ L的PBS中,加入 FITC标记的CD133,PE标记的 CD34,混匀,避光孵育30 min,上流式细胞仪检测。②细胞荧光鉴定:收集的贴壁细胞与 Dil-acLDL(2.4 μ g/mL)在 37℃孵育 1 h后,2%多聚甲醛固定10 min,PBS漂洗后加入FITC-UEA-I(10 μ g/mL)并于37℃避光孵育 1 h,PBS洗涤。激光共聚焦显微镜下观察,Dil-acLDL和FITC-UEA-I双染色阳性细胞被认为是正在分化的EPCs。

1.2.4 实验分组 贴壁细胞随机分成4组。①对照组:先用不含胎牛血清的 M199培养液培养24 h,然后换含空白血清的M199培养液;②芪红合剂含药血清各剂量组(共3组):不含胎牛血清的M199培养液培养24 h后,再分别用含低、中、高剂量含药血清的条件培养液培养24 h、48 h、72 h。

1.2.5 EPCs计数 将各组处理后的EPCs用0.25%胰蛋白酶消化收集,制备成细胞悬液,接种于24孔培养板,每组设6个复孔和空白对照;用Dil-acLDL和FITC-UEA-I对细胞进行荧光染色,双染色阳性细胞被认为是正在分化的内皮祖细胞,倒置荧光显微镜下计数20个随机选择的高倍×200视野EPCs。

1.2.6 EPCs黏附能力检测 用0.25%胰蛋白酶消化收集贴壁细胞;将细胞悬液收集于离心管中,以800/min～1 000/min离心3 min～5 min,弃上清,加培养液,计数;将同等数目的EPCs铺在包被有HFN的24孔培养板,在37℃培养30 min,计数贴壁细胞。

1.3 统计学处理 采用SPSS 11.0软件进行分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,组间比较采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1 EPCs的形态学改变 从外周血分离获得的单个核细胞在倒置显微镜下呈圆形,体积较小;2 d后出现成簇现象,可见少量细胞贴壁;4 d后细胞体积变大,形态不规则,细胞数量增多,弃去悬浮细胞,可见少量梭形细胞和细胞集落形成,细胞集落中间为圆形细胞,周边为梭形细胞,呈放射状排列。培养过程中,贴壁细胞体积逐渐增大,7 d后长梭形状的内皮样细胞明显增多,并可观察到梭形细胞首尾相连形成线状结构。

2.2 EPCs的鉴定 激光共聚焦显微镜下观察发现,DilacLDL阳性细胞显示红色荧光,主要集中在胞浆,FITC-UEA-I阳性细胞显示绿色荧光,主要集中在胞膜。双染色阳性细胞呈黄色为正在分化的EPCs。流式细胞仪检测细胞表面标志,结果显示贴壁细胞表达CD34阳性率为(38.36±3.70)%,CD133阳性率为(13.91±1.47)%。进一步从功能上证实了培养的细胞为EPCs。

2.3 芪红合剂含药血清对人外周血EPCs数量的影响 低、中剂量芪红合剂显著增加EPCs的数量,并且呈时间依赖性增加EPCs的数量,EPCs数量在低剂量芪红合剂作用后24 h开始高于对照组,于72 h达到高峰;中剂量芪红合剂作用后48 h开始高于对照组,于72 h达到高峰;高剂量芪红合剂仅于作用72 h后高于对照组(P＜0.05)。此外,中药芪红合剂含药血清在干预EPCs 48 h、72 h时,EPCs数量呈剂量相关性,低剂量组较中、高剂量组的 EPCs数量明显增高(P＜0.05)。详见表1。

表1 芪红合剂含药血清对人外周血EPCs数量的影响(±s)

表1 芪红合剂含药血清对人外周血EPCs数量的影响(±s)

组别 n 24 h 48 h 72 h对照组 6 37.5±7.5 44.8±4.9 46.1±3.1含药血清低剂量组 6 55.0±4.61) 70.5±8.01) 82.7±9.41)含药血清中剂量组 6 45.3±4.2 57.9±5.71)2) 63.3±6.31)2)含药血清高剂量组 6 45.5±9.3 41.1±7.1 55.2±4.81)2)3)与对照组比较,1)P＜0.05;与含药血清低剂量组比较,2)P＜0.05;与含药血清中剂量组比较,3)P＜0.05

2.4 芪红合剂含药血清对人外周血EPCs黏附功能的影响低、中剂量芪红合剂显著增加EPCs的贴壁细胞数,并且呈时间依赖性增加,低剂量芪红合剂作用后于24 h贴壁细胞数量开始高于对照组,于72 h达到高峰;中剂量芪红合剂作用后于48 h贴壁细胞数量开始高于对照组,于72 h达到高峰,高剂量芪红合剂仅于作用72 h后高于对照组(P＜0.05)。此外,中药芪红合剂含药血清在干预48 h、72 h时,EPCs的贴壁数量呈一定的剂量相关性,低剂量组较中、高剂量组的数量明显增高(P＜0.05)。详见表2。

表2 芪红合剂含药血清对人外周血EPCs黏附功能的影响(±s)

表2 芪红合剂含药血清对人外周血EPCs黏附功能的影响(±s)

组别 n 24 h 48 h 72 h对照组 6 23.8±3.2 25.4±4.2 23.8±5.0含药血清低剂量组 6 31.3±3.11)40.8±4.31) 48.4±4.41)含药血清中剂量组 6 21.2±2.5 31.7±3.41)2) 40.4±3.81)2)含药血清高剂量组 6 21.2±4.2 26.8±3.4 33.0±2.21)2)3)与对照组比较,1)P＜0.05;与含药血清低剂量组比较,2)P＜0.05;与含药血清中剂量组比较,3)P＜0.05

3 讨 论

血管内皮细胞功能障碍(endothelial cell dysfunction,ED)是多种心脑血管疾病发生的共同病理生理改变,其典型病理生理变化是导致血管痉挛、血管异常收缩、血栓形成及血管增生。在动脉粥样硬化、心肌缺血、组织缺血、缺氧再灌注损伤等疾病发展中存在着不同程度的内皮损伤[1]。高血压、高血脂、吸烟、糖尿病、动脉粥样硬化家族史、高龄、等危险因素都可以造成ED[2-4]。1997年,Asahara等[5]首次分离并证实人类出生后的外周循环血液中,存在能分化成为血管内皮细胞的 EPCs。EPCs在成年机体的血管新生中起重要作用,新生血管中25%的内皮细胞是由EPCs分化而来的。研究显示,中医气虚血瘀证与内皮细胞损伤及其功能障碍之间有密切的联系,气虚血瘀可能为血管内皮损伤及功能失调的主要发病机制之一[6]。目前临床及基础研究发现,某些益气活血化瘀类中药对于冠心病、糖尿病、周围血管病、手术及创伤多种疾病的内皮细胞的修复有良好的疗效,具有一定的内皮细胞保护作用[7,8]。益气活血类中药对于内皮细胞的前体细胞EPCs是否有一定的作用,其内皮细胞保护作用机制是否与EPCs途径有关值得探讨。此外,寻找体内动员EPCs或体外促进其向内皮系增殖分化的药物能够对治疗心脑血管病、周围血管病变、糖尿病大血管病变、及手术及创伤等内皮损伤、内皮功能障碍及血管新生相关性疾病意义重要。

中药复方芪红合剂是临床治疗气虚血瘀症的经验方。由黄芪、红花、大黄等组成。诸药配伍,味少力专,共达益气活血,通脉祛瘀之功。临床运用芪红合剂对冠心病、周围血管病变、糖尿病大血管病变、脑血管病等疾病的防治效果满意,能有效改善症状,延缓病情的进展。实验过程中,顺利完成了体外诱导、增殖和分化人外周血EPCs,用制备的低、中、高剂量中药芪红合剂含药血清干预体外培养的EPCs,进一步观察了益气活血化瘀中药复方芪红合剂对人外周血EPCs体外数量和功能的影响。运用中药血清药理学和体外细胞培养技术相结合的方法进行研究,具有一定的创新性。中药复方多数是通过口服而起作用,但是中药粗制剂中含有大量杂质,若直接将中药粗制剂加入体外反应体系进行实验,其渗透性、pH值、蹂质、无机盐等许多非特异性理化因素将严重干扰实验结果,因而其实验结果的可靠性和科学性难以得到认可[9]。中药粗制剂经口服吸收后,再用含药血清进行体外实验,不仅能反映药物中可吸收部分的直接作用,也可反映药物在机体作用下形成的代谢产物和药物诱生的内源性生成物的间接结果,真实反映药物在体内的药理作用,使体外试验能较好地重复在体试验的结果。

本实验采用低、中、高不同剂量的芪红合剂含药血清对EPCs进行干预研究,结果显示,芪红合剂可以增加EPCs的数量,并能改善EPCs的黏附功能,其影响呈一定的量效、时效关系。芪红合剂对EPCs数量及黏附功能的影响随剂量增高而有所降低,而在同一剂量组中,芪红合剂对EPCs数量及黏附功能的影响于24 h作用明显,于72 h达到高峰。提示中药芪红合剂可能具有一定的动员自体EPCs数量和黏附功能的作用,其具体的作用途径有待进一步探讨。

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